Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 155

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 149 150 151 152 153 154 < 155 > 156 157 158 159 160 161 .. 221 >> Следующая

Гибридные мультиферментные комплексы нескольких каталитических доменов могут быть получены и без синтеза длинных химерных полипептидных цепей, содержащих эти домены. Разработка таких альтернативных систем была начата с использования целлюлосомы Clostridium thermocellum, которая обеспечивает гидролиз целлюлозы, служащей источником углерода для этой бактерии. Целлюлосома представляет собой высокоупорядоченный комплекс более 25 ферментов, осуществляющих гидролиз целлюлозы и полисахаридов, ассоциированных с клеточной стенкой клеток растений. Каждая из каталитических субъединиц этого комплекса заякорена на определенных участках полипептидной цепи белка СурА с помощью докериновых доменов (dockerin domains) без привлечения ковалентных связей. В свою очередь, белок СурА, выполняющий скелетные функции, содержит девять высокогомологичных рецепторных последовательностей, названных когезиновыми доменами (cohesin domains), которые связывают каталитические субъединицы целлюлосомы, взаимодействуя с их докериновыми доменами [175].
Докериновые домены могут быть объединены с другими ферментами в составе гибридных полипептидных цепей, что будет обеспечивать взаимодействие таких рекомбинантных белков со скелетной последовательностью СурА. Более того, хотя коге-зиновые домены обладают высокой гомологией, они не полностью идентичны и предпочтительно взаимодействуют с докериновыми доменами определенной первичной структуры. Это создает условия для упорядоченной сборки каталитических субъединиц, вводимых в состав мультиферментного комплекса, на скелетной последовательности по воле исследователя путем линейного упорядочивания когезиновых доменов вдоль полипептидной цепи СурА методами белковой инженерии [176]. Первые результаты использования такого подхода на практике уже получены [177, 178].
Получение ферментов с новыми свойствами путем объединения гомологичных белковых доменов. Случайное объединение участков полипептидных цепей двух близкородственных ферментов, методическое обеспечение которого рассматривалось выше, находит широкое применение в направленной эволюции белков. Однако такой подход порождает большое количество химерных молекул, полностью утративших биологическую активность, так как в ходе подобных манипуляций с большой вероятностью происходит нарушение тонких внутримолекулярных взаимодействий, обеспечивавших функциональность исходных белков.
В отличие от этого продуманный обмен конкретными структурными субдоменами белков, функции которых известны, может приводить к более предсказуемым результатам. Например, сериновые протеиназы семейства S1 состоят из двух гомологичных субдоменов типа (3-баррел, интерфейс которых формирует активный центр типа “клешни”. Гидрофобные коровью структуры и триада каталитических остатков аминокислот консервативны у этой группы ферментов. Однако пептидные петли на поверхности ферментов, окружающие активный центр, заметно варьируют по своей первичной структуре, что коррелирует с уникальными субстратными специфичностями ферментов и особенностями их регуляции. С учетом этих предпосылок была получена гибридная протеиназа fXYa с объединенными N-концевым субдоменом активированного фактора свертывания крови Ха (fXa) и С-концевым субдоменом трипсина [179]. Анализ трехмерной структуры гибридного белка показал, что расположение консервативных гидрофобных участков в окрестностях активного центра в основном было сохранено, однако пространственная структура элементов поверхности белковой глобулы заметно изменилась. Исследование ферментативной активности гибридного белка с помощью искусственных субстратов обнаружило наличие у него амидолитической активности. При этом гибридная протеиназа проявляла менее выраженную субстратную специфичность, чем исходные ферменты, сохраняя высокую способность использовать субстраты, характерную для фактора Ха.
Адресная доставка гибридных белков. Адресные домены (tagging domains) и сигнальные последовательности белков широко используются в белковой инженерии для направленного изменения внутриклеточной и внеклеточной локализации гибридных полипептидов. Разработано большое количество векторов, в том числе и коммерческих, которые позволяют с помощью простых генно-инженерных манипуляций получать гибридные белковые
молекулы, у которых основной функциональный участок объединен с тем или иным адресным доменом или сигнальной последовательностью. Такие модификации могут обеспечивать гибридной молекуле способность к специфической секреции разными бактериальными хозяевами. Функциональность подобным гибридным белкам придает способность адресных доменов претерпевать автономный фолдинг в процессе биосинтеза и, следовательно, оказывать минимальное воздействие на пространственную структуру основной части гибридного белка.
К той же категории относятся и векторы, в которых клонируемые гены объединяют с последовательностями, кодирующими белковые домены со свойствами специфических лигандов или рецепторов. В качестве адресных доменов в настоящее время используют белок, связывающий мальтозу, глютатион-Б-трансфе-разу, домены, взаимодействующие с целлюлозой или хитином, гексагистидиновую последовательность и ряд других. Такие модификации значительно облегчают очистку рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии. Интересной разработкой в данной области является коммерчески доступный вектор, в котором последовательность хитин-связывающего (адресного) домена объединена с последовательностью нуклеотидов интеина дрожжей S. cerevisiae [61]. Во время экспрессии клонированного с помощью этого вектора гена происходит образование гибридного белка, содержащего на С-конце основного рекомбинантного белка интеин и адресный домен. Как уже рассматривалось в разделе 1.3.2 этой части книги, интеины обеспечивают прохождение аутосплайсинга белков, их содержащих. Использованный в данной конструкции интеин был изменен таким образом, что активировался в присутствии реагентов, восстанавливающих сульфгидрильные группы. Поэтому после аффинной сорбции гибридного белка на колонке с иммобилизованным хитином происходит освобождение основного рекомбинантного белка из гибридной молекулы в присутствии дитиотриэтола или (3-меркаптоэтанола как следствие расщепления пептидной связи интеином.
Предыдущая << 1 .. 149 150 151 152 153 154 < 155 > 156 157 158 159 160 161 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed