Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Уже в этих первых опытах было установлено, что фермент в виде кристаллов, содержащих поперечные сшивки, сохранял до 5% своей первоначальной активности. Вскоре последовало дальнейшее исследование возможности достижения большей эффективности в сохранении активности кристаллических ферментов, поскольку повышение их стабильности в такой форме было очевидным. Итогом явилось получение термолизина в виде нерастворимых кристаллов фермента, содержащих поперечные сшивки (crosslinked enzyme crystal - CLEC), и этот термин дал название всей группе подобных методов химической модификации белковых молекул [149]. Модифицированный термолизин CLEC сохранял значительную часть своей исходной ферментативной активности, а полученный таким же образом субтилизин обнаруживал высокую стабильность как в органических, так и водных средах и обладал способностью катализировать синтез пептидов в ацетонитриле [150]. Во всех первых опытах была отмечена низкая активность ферментов CLEC, особенно в органических средах, на фоне их высокой стабильности. Низкую эффективность катализа связывали с пониженной скоростью переноса субстрата и продукта реакции в кристаллах в органических средах. Для преодоления этого недостатка CLEC-ферментов была предложена предобработка кристаллов краун-эфиром 18-краун-6 с последующей лиофилизацией кристаллов. В итоге способность CLEC-суб-тилизина Carlsberg образовывать пептидные связи в органичес-
ких средах была повышена в 13 раз, что связывали с улучшением обмена молекулами воды между активным центром фермента и окружающей средой с участием краун-эфира (см. сводную табл. 15 в конце книги) [151].
Ковалентная модификация ферментов монофункциональными реагентами используется для введения в белки новых функциональных групп, повышения их растворимости в органических средах и других изменений биохимических свойств. Особенной популярностью пользуется модификация ферментов полиэтиленгликолем (ПЭГ), которая приводит не только к стабилизации в органических растворителях, но и сопровождается повышением временем их полужизни в биологических жидкостях, а также снижением антигенности макромолекул, что важно при терапевтическом применении ферментов [152]. Кроме того, для тех же целей используют ковалентные модификации белков амфифильным (содержащим гидрофобные и гидрофильные группы) детергентом полиоксиэтиленлауроило-вым эфиром (Brij 35).
CV_
N\ V~C1 C12H25(0CH2CH2)230\ c12H25(OCH2CH2)23Ov
Я—N E-NH tf *1
C12H25(OCH2CH2)23OH SI-> N y-Cl -----2-*- N 7—NH—E
W rN
C12H25(0CH2CH2)230 / C12H25(0CH2CH2)230
В этом случае наблюдается повышение растворимости ката-
лазы в абсолютном толуоле и 1,1,1-трихлорэтане, причем в по-
следнем растворителе активность модифицированного фермента была в 200 раз выше, чем у исходного белка, а его активность в водных средах была выше в 15-20 раз [153]. Другие многочисленные примеры ковалентных модификаций ферментов с целью введения в них функциональных групп небольшого размера (в том числе и коферментов), а также замещения отдельных атомов можно найти в обзоре [154].
В целом, химические модификации представляют собой группу быстро реализуемых и недорогих методов стабилизации ферментов и изменения их субстратной специфичности путем введения небольших функциональных групп, что невозможно сделать с помощью направленного и случайного мутагенеза. К недостаткам этих методов следует отнести невозможность осуществления контроля за полнотой прохождения реакций и изменения конкретных участков полипептидных цепей. Решение проблемы лежит на пути комбинированного применения направленного мутагенеза с последующей химической модификацией боковых цепей
специально введенных аминокислотных остатков, что, как уже рассматривалось выше, в ряде случаев позволяет преодолевать все упомянутые затруднения.
3.1.2. Оптимизация ферментов для функционирования
в неводных средах
Использование органических растворителей в качестве среды для проведения химических реакций на основе биокатализа имеет много преимуществ перед применением водных сред для осуществления аналогичных реакций [154]. В частности, к несомненным достоинствам данной группы методов относятся повышение растворимости гидрофобных субстратов и сопутствующий этому сдвиг равновесия химической реакции в сторону образования продуктов реакции.
При исследовании структуры ферментов в органических средах было установлено, что кристаллические или лиофильно высушенные полипептиды сохраняют свои основные характерные особенности. Так, с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов субтилизина, содержащих небольшое количество поперечных сшивок, было продемонстрировано, что фермент в таких условиях не изменяет свою общую структуру, а структура активного центра практически не отличается от таковой в водных растворах и других органических растворителях [155]. Похожие данные были получены и с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR spectroscopy) [156]. На основании таких результатов были сделаны выводы о независимости свойств ферментов как биокатализаторов от природы органических растворителей. Несмотря на то, что способность ферментов к катализу зависит от состава среды, эту зависимость нельзя объяснить изменениями их структуры. В отличие от кристаллических и лиофильно высушенных форм, у ферментов, находящихся в растворе, наблюдалось изменение вторичной структуры, которое зависело от природы использованного органического соединения и коррелировало с изменениями уровней ферментативной активности растворенных белков. Особенно сильная потеря активности имеет место при значительном отклонении структуры а-спиральных участков и (3-слоев ферментов от таковой, наблюдаемой в водных растворах.
