Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
стратной специфичности субтилизина в отношении ацилирова-ния нуклеозидов в органических средах [166]. Лиофилизация субтилизина в присутствии нуклеофильных субстратов стимулировала способность фермента ацилировать нуклеозиды и углеводы в органических растворителях. В том случае, если импринтинг осуществляли в присутствии сахарозы, имела место 40-кратная стимуляция способности ацилировать сахарозу по сравнению с исходным ферментом, а скорость ацилирования тимидина возрастала только в четыре раза. Обратную картину наблюдали, если для импринтинга использовали тимидин: происходила девятикратная стимуляция ацилирования сахарозы и 52-кратное увеличение скорости реакции при применении тимидина в качестве субстрата. Другие примеры использования всех вышеперечисленных подходов приведены в табл. 15 (см. далее). Этими примерами мы заканчиваем далеко не исчерпывающее рассмотрение приложения химических методов к белковой инженерии и переходим к обсуждению недавних достижений в конструировании белков и ферментов с помощью подходов, целиком основанных на методах молекулярной генетики.
3.2. Г ибридные белки
Гибридные (химерные) белки представляют собой полипеп-тидные цепи, искусственно составленные из фрагментов природных белков разного происхождения. Современные методы генной и белковой инженерии позволяют вводить в полипептидные цепи элементы вторичной структуры других белков, встраивать новые функциональные домены, заменять одни функциональные домены на другие, а также объединять целые белковые молекулы в одной полипептидной цепи. Из этого следует, что создание гибридных белков является одной из разновидностей рационального редизайна белковых молекул.
Целью конструирования гибридных белков является улучшение свойств, имеющихся у исходных макромолекул, для более производительного их использования в биотехнологии, а также создание белков и ферментов с новыми свойствами. Работы в области гибридных белков, с одной стороны, направлены на изменение кинетических параметров ферментов, их субстратной специфичности, оптимума pH, термостабильности и других биотехнологических параметров. При другом подходе усилия исследователей сосредоточены на создании бифункциональных и многофункциональных белковых молекул, объединяющих в одной полипептидной цепи несколько функционирующих доменов.
3.2.1. Гибридные ферменты
В условиях живой клетки ферменты не существуют сами по себе в виде отдельных молекул.
С помощью современных систем исследования белок-белковых взаимодействий in vivo даже у одноклеточных организмов выявлены гигантские сети взаимодействующих белков, в организацию которых вовлечены тысячи макромолекул [167]. Организация цитоплазмы на молекулярном уровне создает условия для строгого упорядочивания метаболических процессов и их глобальной регуляции. Наиболее сильные взаимодействия такого рода удается наблюдать путем экспериментальной очистки и изучения многофункциональных ферментных комплексов и белковых систем. В подобных комплексах имеет место строгая пространственная упорядоченность каталитических субъединиц, которая обеспечивает определенную последовательность протекания ферментативных реакций путем канализированной передачи промежуточных продуктов метаболизма от одного активного центра к другому, что значительно повышает эффективность этих процессов.
Одними из наиболее впечатляющих примеров мультифер-ментных комплексов являются природные системы синтеза поли-кетидов и нерибосомного синтеза пептидов. Во всех этих случаях синтез происходит путем последовательного добавления к продуктам реакции химических элементов с помощью пространственно упорядоченных ферментных модулей [168, 169]. Каталитические модули, в свою очередь, являются частью многомодульных полипептидов, которые образуют гигантские синтазные комплексы, осуществляющие полный синтез поликетидов и пептидов. Таким образом, природа и пространственная организация модулей полностью определяют структуру конечного продукта, синтезируемого с их участием. Продемонстрирована возможность искусственного изменения структуры конечных продуктов реакции путем генно-инженерных модификаций, влияющих на структуру и взаимное расположение каталитических модулей, и это направление является предметом интенсивных исследований [170, 171].
Искусственные бифункциональные и полифункциональные ферменты. Потенциальная возможность создания бифункциональных ферментов на основе гибридных белков была реализована в конце 1980-х гг. с целью осуществления сопряженных ферментативных реакций. Были получены гибридные белки, объединяющие в одной полипептидной цепи (3-галактозидазу и галактозодегидрогеназу [172], галактозодегидрогеназу и бактериальную люциферазу [173], а также малатдегидрогеназу и цит-ратсинтазу [174]. Суммарная активность таких систем в стацио-
нарном состоянии была в два-три раза выше, чем активность смесей отдельных ферментов, а лаг-период перед выходом систем в стационарное состояние был в четыре-шесть раз короче. Максимальное увеличение эффективности в сопряженных системах наблюдали в условиях, когда прохождение первой стадии реакции лимитировало весь процесс, например, в неоптимальных для первого фермента значениях pH или при дефиците его субстрата. Ожидается, что в будущем точное позиционирование активных центров каталитических доменов в гибридных бифункциональных ферментах друг относительно друга должно значительно повысить эффективность таких систем.
