Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Экспрессия гибридных белков на поверхности бактериальных клеток. Еще одним интенсивно развивающимся направлением белковой инженерии, которое использует адресные домены и сигнальные последовательности, является экспонирование рекомбинантных белков на поверхности бактериальных клеток для создания бактериального дисплея, живых вакцин, а также иммобилизации самих клеток в процессе культивирования. Применение бактериального дисплея для направленной эволюции белков
было подробно рассмотрено выше (раздел 2.3.2) [109]. В основном те же самые принципы используются и для экспрессии на клеточной поверхности антигенных эпитопов, обеспечивающих проведение вакцинации.
Адресная доставка гибридных белков к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. Технологии гибридных белков могут быть использованы для доставки полипептидов к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. В частности, путем объединения доменов типа “цинковые пальцы”, участвующих в распознавании последовательностей ДНК факторами транскрипции, с каталитическим доменом рестриктазы Fokl удается изменить специфичность действия этой эндонуклеазы [180].
С помощью аналогичного подхода можно изменять специфичность и самих факторов транскрипции, что удалось продемонстрировать с помощью гибридных а-субъединиц РНК-поли-меразы Е. coli. В этих опытах объединяли N-концевую часть основной а70-субъединицы с С-концевой последовательностью а32-субъединицы, которая обеспечивает распознавание РНК-поли-меразой Е. coli промоторов генов теплового шока. Полученный гибридный белок после объединения с минимальным ферментом РНК-полимеразы, не содержащим а-субъединицу, придавал ему способность инициировать транскрипцию на гибридных промоторах, составленных из консенсусных (-35)-последовательности а32-зависимых промоторов и (-Ю)-последовательности промоторов а70 [181]. Путем замены в молекуле РНК-полимеразы Е. coli а-субъединицы дикого типа на гибридную а-субъединицу, которая содержала С-концевой домен а-субъединицы В. subtilis получали фермент, регулируемый активатором транскрипции этой бактерии [182].
Реконструкция факторов транскрипции из отдельных химерных белков широко применяется в последнее время в дигибридных системах, используемых для исследования белок-белковых взаимодействий. Принцип действия таких систем и особенности их функционирования уже подробно рассматривались в разделе 2.3.4.
Проектирование аллостерических взаимодействий в многофункциональных белках с искусственно объединенными доменами. У большинства гибридных бифункциональных и многофункциональных белков, полученных по обсуждаемым выше технологиям, каталитические домены соседствуют друг с другом в полипептидной цепи и, по-видимому, приобретая свою пространственную структуру в результате независимого фолдинга, обладают значительной конформационной свободой. Это повышает ве-
роятность сохранения функциональной активности доменов в новом для них окружении, но в то же время приводит к отсутствию оптимальной взаимной ориентации каталитических центров доменов, а их относительная независимость затрудняет осуществление координированных регуляторных воздействий на активность всего гибридного белка. В этой связи, одним из направлений исследований в данной области белковой инженерии является разработка подходов к обеспечению аллостерических взаимодействий между отдельными активными центрами многофункциональных гибридных белков и остальными частями молекул. Реальным путем функционального сближения независимых каталитических доменов может быть их физическое сближение, в том числе размещение одного домена внутри другого.
Возможность реализации такой стратегии на практике была продемонстрирована для гибридных белков, объединяющих в одной полипептидной цепи бактериальные |3-лактамазу и мальто-декстрин-связывающий белок MalE [183]. Были получены генно-инженерные конструкции, в которых последовательность (3-лак-тамазы соединяли либо непосредственно с С-концом белка MalE, либо встраивали внутрь его полипептидной цепи. Оказалось, что в том случае, если полипептидную цепь (3-лактамазы встраивали после а.о. 133 или 303 MalE, секретируемый в периплазматичес-кое пространство гибридный полипептид сохранял активность обоих ферментов. Эти участки полипептидной цепи MalE были выбраны потому, что локализованные здесь короткие делеции и вставки не оказывали влияния на активность белка. С-Концевые модификации MalE приводили к образованию гибридного белка с теми же активностями, и который кроме того был менее чувствителен к деградации эндогенными протеиназами, а в присутствии мальтозы (3-лактамазный домен становился более устойчивым к денатурации мочевиной. Таким образом, в гибридной полипептидной цепи имели место аллостерические взаимодействия между двумя каталитическими доменами.
Рекомбинантные ферменты, обладающие аллостерическими свойствами, могут быть использованы для создания новых био-еенсоров. В частности, попытки проведения модификаций такого рода были предприняты в отношении щелочной фосфатазы [184]. Пептидные эпитопы, специфичные для ВИЧ типа I и вируса гепатита С, были встроены в полипептидную цепь щелочной фосфатазы, после чего исследовали влияние антител к этим эпитопам на активность рекомбинантных ферментов. Установлено, что антитела снижали на 20% активность гибридных ферментов, Полученных на основе щелочной фосфатазы дикого типа, однако
