Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Зеленый флуоресцирующий белок, благодаря своей способности к аутофлуоресценции, активно используется в качестве репортера для исследования в реальном времени молекулярных процессов, происходящих в живых клетках. Одно из ограничений его применения связано с наличием в клетках других флуоресцирующих молекул, которые в ряде случаев снижают чувствительность обнаружения GFP. Кроме того, значительная внутриклеточная стабильность этого белка (у GFP дикого типа время полу-жизни более 24 ч) затрудняет его использование для оценки транскрипционной активности генов, так как его внутриклеточное содержание уже может не коррелировать с наличием соответствующих мРНК. В таком случае используют менее стабильный мутантный аналог EGFP, так называемый дестабилизированный EGFP (d2EGFP), время полужизни которого в клетке составляет ~2 ч. d2EGFP оказывается пригодным для исследования изменения уровней экспрессии генов в процессе передачи сигналов, в том числе при внешних воздействиях на клетку, что успешно применяется фармацевтическими фирмами для скрининга новых лекарственных препаратов [190].
GFP и его аналоги представляют собой исключительно удобные белки-репортеры для анализа экспрессии генов [193]. В частности, добавление к любому из концов его полипептидной цепи сигнальных последовательностей не нарушает способность GFP к флуоресценции, однако позволяет контролировать его внутриклеточную локализацию в исследуемых компартментах, например, в ядре или митохондриях. Объединение GFP в одной гибридной полипептидной цепи с белковыми рецепторами (в частности, глюкокортикоидным) или лигандами, также часто не нарушает функциональных свойств ни одной из макромолекул гибрида. С помощью такой системы можно следить за перемещением соответствующих белков и их комплексов в живых клетках и тканях как при проведении фундаментальных исследований, так и прикладных, например при разработке систем для геноте-рапии.
GFP-подобные белки Anthozoa в настоящее время эффективно используются в качестве пассивных белков-репортеров при исследовании регуляторных элементов генов бактерий, жи-
вотных и растений. Кроме того их применяют в качестве репортеров активации генов в биосенсорах, основанных на бактериальных клетках, при исследовании механизмов дифференци-ровки клеток, для слежения за динамикой внутриклеточных перемещений белков, органелл и вирусных частиц, при исследовании механизмов фагоцитоза. Интересные перспективы в применении этих белков открываются в связи с недавним обнаружением способности исходно нефлуоресцирующих белков asulCP приобретать эту способность после облучения зеленым светом. Через некоторое время белок возвращается в свое первоначальное состояние или может быть искусственно “потушен” облучением голубым светом. В результате мутагенеза генов белков этого семейства в группе К.А. Лукьянова (ИБХ, Москва) были получены так называемые зажигающиеся флуоресцирующие белки (kindling fluorescent proteins - KFPs), которые под действием света определенной длины волны могут быть превращены из CP-белков во флуоресцирующие FP. Более продолжительное облучение исходных молекул может переводить их в необратимое “зажженное” состояние. Активированные таким образом KFP начинают флуоресцировать в красной области спектра, что может быть использовано для слежения за перемещением клеток в тканях или внутриклеточным движением органелл. Кратковременное обратимое “зажигание” таких белков позволяет последовательно получать картины флуоресцирующих биообъектов в разные промежутки времени эксперимента. Более того, высушенные KFP сохраняют способность претерпевать аналогичные превращения под действием света, следовательно могут быть использованы для получения биосенсоров, а также в современных нанотехнологиях для хранения информации и других не менее важных целей.
3.2.3. Гибридные токсины
Концепция “магической пули”, которая бы избирательно поражала больные (в том числе раковые) клетки и оставляла невредимыми здоровые, до сих пор остается востребованной. Идеальное лекарственное средство строго специфического (избирательного) действия должно обладать, по крайней мере, следующими структурно-функциональными особенностями (рис. 53, а). Препарат должен заключать в себе действующее начало для достижения физиологического эффекта и лиганд, распознающий рецептор на поверхности клеток-мишеней. Кроме того, в нем должны быть структурные элементы, узнаваемые системой
Лиганд Переносчик Спейсер Действующее начало
Узнавание Защита, Отщепление Физиологический
мишени транспорт лекарства эффект
б
1а II lb III СООН
252
в
365 404 II
613
III
Рис. 53. Лекарственные препараты направленного действия на основе гибридных токсинов
а - обобщенная схема структуры лекарственного препарата направленного действия;
б - строение псевдомонадного токсина (цифрами обозначено положение аминокислотных остатков);
