Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
в - строение гибридного токсина;
г - гибридный токсин на основе моноклональных миниантител
транспорта организма, для доставки лекарства к клеткам-мишеням, а также спейсерный участок, необходимый для отделения действующего начала от остальных функциональных частей препарата после его доставки по адресу. Именно такая идеальная схема реализуется в природном экзотоксине Pseudomonas aeruginosa. Исследование возможности его использования в качестве действующего начала в гибридных токсинах было проведено одним из первых И. Пастаном [195].
Экзотоксин А P. aeruginosa представляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, которая организована в три функциональных домена (см. рис. 53, б). N-Концевой домен 1а (аминокислотные остатки 1-252) необходим для взаимодействия с рецепторами а2-макроглобули-на на поверхности клеток-мишеней (прототип лиганда идеального лекарства направленного действия) [196]. Функции домена lb (аминокислотные остатки 365-404) неизвестны, и он может быть удален из полипептидной цепи токсина без потери активности. Домен II (аминокислотные остатки 253-364) обеспечивает эффективный перенос токсина в цитозоль клеток (система транс-
порта лекарства), а домен III (аминокислотные остатки 405-613) осуществляет ADP-рибозилирование фактора элонгации трансляции EF2, что приводит к подавлению трансляции и гибели клеток-мишеней. Эффективность действия псевдомонадного токсина чрезвычайно высока. Его внутривенное введение мышам в количестве 0,3 мкг приводит к смерти животных в течение суток. А гибель культивируемых клеток вызывает еще меньшее количество молекул токсина.
Таким образом, для оказания цитотоксического действия экзотоксину А необходимо с помощью домена 1а распознать рецепторы на поверхности клеток, проникнуть в клетку с помощью эн-доцитоза, опосредованного рецепторами, и быть транслоциро-ванным через внутреннюю мембрану в цитозоль, где локализуется фактор EF2 [196]. Основная идея в создании токсинов направленного действия заключалась в том, чтобы заменить домен 1а на какой-либо иной пептидный лиганд, взаимодействующий с другой группой рецепторов на поверхности клеток, и тем самым изменить специфичность действия токсина в отношении самих клеток (рис. 53, в).
Было установлено, что удаление домена 1а генно-инженерными методами резко (в сотни и тысячи раз) снижает токсичность такого укороченного белка как в отношении клеток различных линий, так и in vivo. Присоединение к С-концевой части укороченного полипептида молекулы интерлейкина 2 человека осуществляли путем объединения структурных частей соответствующих генов в экспрессирующем векторе. Очищенный гибридный токсин оказался чрезвычайно токсичным в отношении клеток, несущих на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, и не действовал на клетки, у которых эти рецепторы отсутствовали и которые погибали под действием природного токсина. Интернализация (транслокация внутрь клеток) гибридного токсина была опосредована субъединицами р55 и р70 рецептора интерлейкина 2. Таким образом, в результате действия гибридного токсина на популяцию клеток, часть из которых экспрессирует на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, происходит избирательная гибель именно этих клеток.
В организме большинство покоящихся Т-клеток и Т-клеток памяти не экспрессируют на своей поверхности высокоаффинных рецепторов интерлейкина 2, тогда как Т-клетки, стимулированные аллоантигенами, содержат такие рецепторы. Поэтому внутрибрюшинное введение гибридного токсина крысам с экспериментальным артритом - заболеванием, обусловленным патологической активацией Т-клеток, снижало симптомы заболева-
ния. Гибридный токсин существенно уменьшал у мышей и реакции отторжения трансплантата.
Вслед за этими пионерскими работами последовала целая серия исследований, направленных на создание аналогичных систем адресной доставки различных цитотоксических полипептидов. В процессе дальнейшего усовершенствования системы адресной доставки псевдомонадного токсина с использованием интерлейкина 2 в качестве лиганда исследователи отказались от полного удаления адресного домена токсина и ограничились его инактивацией путем введения в ген токсина четырех сайт-специ-фических мутаций. Молекулы такого гибридного токсина оказались в 10—100 раз более эффективными цитотоксическими агентами против клеток человека и обезьян, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы для интерлейкина 2, а также обладали значительно большим временем полужизни в крови мышей in vivo по сравнению с ранее полученной конструкцией.
На основе псевдомонадного токсина были созданы гибридные токсины, содержащие в качестве лигандов полипептидные цепи интерлейкинов 4 и 6, трансформирующего фактора роста типа а и инсулиноподобного фактора роста I. Для всех этих гибридных белков была показана высокоспецифическая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (включая клетки мие-ломы человека), обладающих соответствующими рецепторами. Использование в гибридном токсине в качестве лиганда части полипептидной цепи CD4 - гликопротеина поверхности Т-клеток, который является рецептором вируса ВИЧ и взаимодействует с его антирецептором, гликопротеином gpl20, позволило избирательно поражать Т-клетки, зараженные вирусом ВИЧ и экспрессирующие на своей поверхности вирусный белок gp 120.
