Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Колентерамид
Вид сверху
Рис. 52. Структурные и функциональные особенности системы эквори-на и GFP [193]
а - предполагаемый механизм реакции хемилюминесценции, осуществляемой экворином;
б - пространственная структура GFP. Молекула содержит 11 |3-слоев, окружающих центральный а-спиральный участок;
в - механизм образования хромофора в GFP из трех аминокислотных остатков его полипептидной цепи; Р - продолжение полипептидной цепи
ионов в различных компартментах живой клетки. Экворин также применяется в качестве эффективного репортера, так как его наличие уже в аттомолярных концентрациях можно легко обнаруживать при низких значениях сигнала фоновой биолюминесценции.
Экворин отвечает большинству требований, предъявляемых к белкам-репортерам. Тем не менее, широкое его использование в молекулярно-биологических исследованиях, по-видимому, сдерживается зависимостью от внешнего субстрата, колентера-зина, а также характером люминесценции, которая происходит в виде вспышки с продолжительностью ~5 сек, что создает определенные затруднения в детекции белка в динамических опытах. Однако благодаря чрезвычайно высокой чувствительности систем, созданных на основе экворина, он постепенно внедряется в практику, хотя несоизмеримо более низкими темпами, чем его природный партнер - GFP.
Зеленый флуоресцирующий белок и его производные. Первоначально обнаруженный в медузе GFP синтезируется и другими морскими организмами. У медузы этот белок осуществляет смещение спектра биолюминесценции из голубой области в зеленую, что сопровождается повышением квантового выхода, уменьшением светорассеяния и распространением света на большие расстояния. Полипептидная цепь GFP построена из 238 а.о. молекулярной массы 27 кДа и организована в 11-цепочечный (3-ствол, внутри которого находится а-спиральный участок (рис. 52, б). Хромофор GFP представляет собой 4-(и-гидроксибен-зилиден)-имидазолидин-5-он, образуемый в результате посттран-сляционной модификации полипептидной цепи, в которой участвуют аминокислотные остатки Ser-65, Туг-66 и Gly-67. Образование хромофора происходит в два этапа: реакции циклизации между этими аминокислотными остатками и последующего окисления с участием молекулярного кислорода. Путем укорачивания полипептидной цепи было показано, что, за небольшим исключением, для функционирования белка важны все его аминокислотные остатки. Изменение полипептидной цепи GFP с помощью мутаций позволяет повышать или понижать стабильность белка, увеличивать эффективность образования его хромофора и получать молекулы с новыми спектральными характеристиками, представленными в табл. 12.
GFP дикого типа обладает двумя максимумами поглощения при 395 и 470 нм и одним максимумом испускания при 509 нм. Наличие двух максимумов поглощения обусловлено присутствием двух химически различающихся форм хромофора - анион-
Флуоресцентные свойства GFP и его мутантных производных
Мутант Мутации Возбуждение Испускание Квантовый
макс. (нм) макс. (нм) выход
Дикий тип 395 (470) 509 0,77
EGFP S65T 488 509 0,70
BFP Y66H, Y145F 380 440 0,20
YFP S65G, V68L, 513(498) 527 0,63
S72A, T203Y
CFP T66W 433 (453) 475 (501) 0,24
Примечание. В скобках отмечены дополнительные максимумы.
ной и нейтральной. Замена Ser-65 —> Thr приводит к образованию мутанта, получившего название улучшенного GFP (enhanced GFP-EGFP) с единственным максимумом возбуждения при 488 нм. Этот аналог, в отличие от белка дикого типа, может претерпевать эффективный фолдинг при 37 °С, и интенсивность его флуоресценции в живых клетках значительно выше, чем у исходного белка. Двойной мутант Туг-66 —> His, Туг-145 —> —> Phe, получивший название голубого флуоресцирующего белка (BFP), после возбуждения при 381 нм испускает свет с длиной волны 445 нм. Голубое излучение BFP может возбуждать EGFP, в связи с чем одновременное использование пары этих белков в качестве репортеров позволило разработать популярную группу методов на основе резонансного переноса энергии при флуоресценции (fluorescence resonance energy transfer - FRET). Два других мутанта - циановый флуоресцирующий белок (CFP) и желтый флуоресцирующий белок (YFP) также применяются во FRET-системах.
Замечательным свойством GFP является его полная функциональная независимость от каких-либо дополнительных кофакторов. Кроме того, белок мало токсичен для клеток, легко обнаруживается и его внутриклеточное содержание можно оценивать количественно с высокой точностью. GFP стабилен при значениях pH 5-12, устойчив к действию протеиназ и высоких температур (вплоть до 65 °С), не инактивируется в присутствии детергентов (1% SDS), 6М хлористого гуанидина, а также в препаратах, фиксированных формальдегидом. При этом флуорофор практически не обесцвечивается в процессе флуоресцентной микроскопии. Из-за небольшого размера GFP оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка-партнера, что делает особенно удобным его использование в генно-
