Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Жгутиконосцы (Gonylaulax; Тетрапиррол; Н+ 475
Pyrocystis)
Стрекающие (Aequorea; Obelia) Колентеразин; Са2+ 460-490
Аннелиды (Diplocardia) N-Изовалерил-З-аминопропа- 500
нал; Н202
Моллюски (Latia) Енолформиат; терпен 500
ароматического альдегида
Ракообразные (Vargula; Ядро имидазопиразина 560
Cypridina)
Насекомые (Photinus; Photuris) (Бензо)тиазол; ATP; Mg2+ 465
происходит ферментативная реакция окисления субстратов, известных под общим названием люциферинов, сопровождаемая испусканием видимого света. В таких процессах участвуют окси-геназы, получившие название люцифераз, которые, как правило, используют молекулярный кислород для окисления связанных с ними люциферинов, переводя эти молекулы в возбужденное состояние по следующему механизму (звездочка обозначает возбужденное состояние молекулы):
Люциферин + 02 (или Н202) —>
—> Оксилюциферин* —> Оксилюциферин + hv
Субстраты в различных реакциях биолюминесценции существенно различаются по своей структуре и принадлежат к разным классам химических соединений. Примеры светящихся организмов и их субстратов приведены в табл. 11 [186].
Сам процесс свечения живых организмов также может быть различным. Одни организмы обладают способностью испускать свет непрерывно, тогда как другие - короткими вспышками, которые продолжаются менее 10 сек. В последнем случае в начале вспышки происходит быстрый запуск химической реакции с последующим истощением субстрата и его мобилизацией к моменту следующей вспышки. Запуск реакции в этом случае может быть результатом быстрого изменения значений pH в светящейся органелле, доступности молекул кислорода или ионов кальция [187]. В настоящее время охарактеризованы, по крайней мере,
семь фотопротеинов: талассиколин (thalassicolin), экворин (aequorin), митрокомин (mitrocomin), также известный как халис-таурин (halistaurin), клитин (clytin), известный и под именем фиа-лидина (phialidin), обелин (obelin), мнемиопсин (mnemiopsin) и бе-ворин (bevorin). Среди Са2+-зависимых фотопротеинов экворин был выделен и охарактеризован одним из первых в 1962 г. и в последующие годы вместе с ассоциированным с ним зеленым флуоресцирующим белком получил широкое распространение в качестве белка-репортера в искусственных генетических системах.
Система экворина и зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein - GFP) вызывает характерное свечение тела медузы Aequoria victoria, которая имеет форму зонтика, диаметром 7-10 см и обитает в северо-западной части Тихого океана. Световой орган медузы представлен мелкими гранулами, распределенными по краю зонтика. О. Шимомуре с соавт. удалось показать, что препараты медузы в присутствии КС1 светятся зеленым светом, а после лизиса клеток - голубым [188]. Позднее было установлено, что голубое свечение обусловлено Са2+-связывающим фотобелком экворином, а зеленое - GFP, возбужденным в результате переноса энергии без излучения от экворина. Этот феномен биолюминесценции редко встречается в живой природе и характерен, главным образом, для морских организмов. Экворин обладает широким спектром люминесценции с максимумом при 469 нм, тогда как спектр флуоресценции GFP узок, и его максимум находится при 508 нм [189].
Экворин. Фотобелок экворин состоит из трех компонентов: апоэкворина, колентеразинового хромофора и молекулярного кислорода [190]. Полипептидная цепь экворина, построенная из 189 а.о., содержит три Са2+-связывающих сайта. После связывания ионов Са2+ экворин претерпевает конформационную перестройку, сопровождаемую окислением связанного с ним коленте-разина с образованием нестабильного производного диоксетано-на, что приводит к освобождению молекулы С02 и кванта света (рис. 52, а). При этом люминесценцию экворина индуцируют ионы Са2+ в пределах концентраций 0,1-10 мкМ. Регенерацию экворина проводят, диализуя препарат белка против ЭДТА для удаления ионов Са2+, с последующим добавлением колентеразина. По данным рентгеноструктурного анализа молекула экворина содержит гидрофобную центральную часть, с которой ассоциирован колентеразин, находящийся в форме перекиси. Испускание света экворином зависит от концентрации ионов Са2+, что позволяет его использовать для количественного определения данных
y^Q~oh
НО
Колентеразин
оц~0”с
но
-со,
Производное диоксетанона б
Вид сбоку
o-cQ-^
