Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Одним из таких подходов, имеющих прямое отношение к обсуждаемой теме, является отбор белковых лигандов фагового дисплея непосредственно в живом организме [100, 101]. В этом случае суспензию фаговых частиц дисплея вводят в кровоток экспериментального животного, через некоторое время животное забивают и из исследуемого органа выделяют находящиеся там фаговые частицы. Выделенные фаги размножают в бактериальных клетках и проводят новый раунд отбора. После нескольких раундов удается выделять фаговые частицы, специфически задерживаемые данным органом, а следовательно, экспрессирующие на своей поверхности лиганды, специфичные в отношении рецепторов органа (или ткани). При этом остальные органы и ткани организма осуществляют отрицательный отбор тех фаговых частиц, которые экспрессируют лиганды универсальной специфичности и взаимодействуют со всеми органами и тканями организма. С использованием такой системы отбора пептидов фагового дисплея удалось получить пептидные аптамеры, специфически взаимодействующие с многими тканями экспериментальных животных [102-105], в том числе с клетками гладких мышц мышей в области рестеноза [106], а также эпителием атеросклеротических сосудов [107].
Антитела, полученные с помощью фагового дисплея на чистых мышиных моделях, часто реагируют с теми же антигенами грызунов других видов и человека. Это редко удается наблюдать при создании моноклональных антител (шАЬ) на основе гибри-домной технологии, поскольку организм иммунизируемого животного должен быть толерантен к эпитопам с подобной эволюционной консервативностью. Сама по себе консервативность таких аминокислотных последовательностей может указывать на их важное функциональное значение. Тем не менее, не всегда специфичность создаваемых антител является универсальной и распространяется на соответствующие антигены человека.
Одним из путей решения этой проблемы является использование мышей линий nude, SCID или SCID/NOD, которым трансплантируют ткани человека. Поскольку у мышей nude отсутствует тимус, мыши SCID не содержат Т- и В-лимфоцитов, а мыши SCID/NOD дефицитны в отношении нормальных киллеров, реакции отторжения трансплантата у них резко снижены. Хотя кровеносные сосуды мышей прорастают в трансплантат, его сосудистая система не является полностью мышиной и сохраняет генетические маркеры организма-донора.
В одном из экспериментов мышам линии SCID была пересажена синовиальная оболочка человека от пациентов с ревмато-
ядным артритом или остеоартритом, а другим мышам - ткань кожи в качестве контроля. Мышам вводили внутривенно суспензию фаговых частиц из клонотеки фагового дисплея, экспрессирующего семизвенные пептиды со случайной последовательностью [108]. Через 15 мин после инъекции трансплантаты изолировали, гомогенизировали и использовали для выделения фаговых частиц, которые далее размножали в бактериальных клетках и подвергали еще двум дополнительным циклам отбора по той же схеме. В результате были получены пептиды, специфически взаимодействующие с сосудистой системой синовиума, но не кожи, которые рассматриваются в качестве перспективных лигандов для адресной доставки лекарственных препаратов к пораженным тканям. Отбор in vivo пептидов и белков, экспрессирующихся в фаговом дисплее, может быть применен и для разработки новых лигандов белковой природы, специфичных в отношении других тканей, в том числе и опухолевых, что может быть использовано для лечения соответствующих заболеваний.
2.3.2. Клеточный дисплей
Использование поверхности живых клеток в качестве дисплея для белков, подвергаемых отбору в ходе направленной эволюции, обладает рядом преимуществ перед применением для тех же целей классического фагового дисплея [109,110]. Прежде всего, клеточный дисплей дает возможность анализировать белки значительно большего размера. Введение флуоресцентной метки в лиганды к рецепторам, экспрессирующимся на поверхности клеток, позволяет эффективно использовать проточную цитометрию для отбора соответствующих рецепторов. С помощью современных цитометров можно анализировать и сортировать до 50 ООО клеток/сек и, следовательно, проводить быстрый скрининг больших комбинаторных клонотек белков и пептидов. При этом, В отличие от фагового дисплея, на поверхности клеток может экспрессироваться множество (до 104) молекул анализируемого белка, что понижает отношение интенсивности сигнала к шуму и Дает возможность более эффективно исключать ложноположительные результаты. Такие параметры систем на основе клеточного дисплея позволяют in situ количественно определять константы связывания и скорости диссоциации комплексов, формирующихся на поверхности клеток.
Все вышеперечисленные особенности делают клеточный дисплей весьма привлекательным для белковой инженерии и не только. Системы клеточного дисплея используют для производ-
ства живых вакцин, создания биоадсорбентов с целью удаления из окружающей среды токсических веществ и ионов тяжелых металлов, получения биокатализаторов в виде целых клеток с иммобилизованными на их поверхности ферментами, биосенсоров для диагностики и мониторинга окружающей среды. В качестве исходных клеток при создании клеточного дисплея применяют клетки микроорганизмов (грамотрицательных и грамположи-тельных бактерий, а также дрожжей) и животных.
