Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Результаты, полученные при скрининге пептидных клонотек на основе фагового дисплея, можно разделить на две группы [96].
Чашка Петри, покрытая стрептавидином
Рис. 47. Схема отбора фаговых частиц, обладающих требуемыми эпитопами
Показаны три рекомбинантных фаговых частицы, экспрессирующие разные эпитопы в составе белка pill. Только эпитоп центральной фаговой частицы распознается молекулой биотинилированного антитела, иммобилизованного на чашке Петри с помощью стрептавидина и использованного для скрининга клонотеки
Прежде всего были получены многочисленные пептиды, имитирующие линейные эпитопы белковых молекул, т.е. соответствующие группе аминокислотных остатков, расположенных подряд друг за другом в полипептидной цепи молекулы антигена. В одной из таких работ из клонотеки были выделены пептиды, последовательность аминокислот которых резко отличалась от последовательности аминокислот истинного эпитопа исследуемого антигена. Тем не менее, такой пептид прочно связывался со специфическими антителами и конкурировал за связывание с природным антигеном. Это позволило сделать вывод о возможности су-
ществования мимотопов - коротких пептидов, имитирующих природные эпитопы, последовательности аминокислот которых существенно различаются между собой. Удалось установить канонические последовательности аминокислот пептидов, имитирующих эпитопы природных белков, а среди них идентифицировать аминокислотные остатки, играющие ключевую роль во взаимодействии антиген-антитело.
Одним из многообещающих приложений клонотек пептидов является идентификация пептидных лигандов, имитирующих “структурные” эпитопы, образующиеся на поверхности белковых глобул в результате сворачивания полипептидных цепей, что сопровождается пространственным сближением аминокислотных остатков, расположенных в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга. С помощью пептидных клонотек возможна идентификация пептидных аналогов различных эпитопов небелковой природы. По-видимому, в ближайшем будущем возможно использование пептидных клонотек для получения новых лекарственных препаратов, создания диагностических средств и производства эффективных вакцин. В области конструирования новых лекарственных препаратов усилия исследователей могли бы быть направлены на создание пептидных лигандов, специфически взаимодействующих с рецепторами, представляющими медико-биологический интерес. Знание структуры таких лигандов позволило бы упростить получение на этой основе лекарственных препаратов небелковой природы.
Клонотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием клонотеки эпитопов, в принципе, можно получать пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.
Клонотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток для выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями
для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью клонотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий.
Фаговый дисплей в исследовании ферментов. С 1991 г. с помощью фагового дисплея было исследовано более 30 ферментов [97]. Поскольку перед встраиванием в фаговую оболочку гибридные белки должны быть как минимум перенесены в периплазма-тическое пространство бактериальных клеток, наибольшей эффективности фагового дисплея удается достичь с секретируемы-ми белками: протеиназами, бактериальными секретируемыми и периплазматическими ферментами, антителами и др. Помимо этого ограничения имеется немало и других узких мест, которые мешают эффективному использованию системы для изучения полноразмерных полипептидных цепей ферментов.
Прежде всего, это необходимость правильного фолдинга исследуемого полипептида в составе гибридной молекулы, что особенно проблематично в том случае, когда белок имеет небактериальное происхождение. Кроме того, рекомбинантный белок, будучи экспонированным на поверхности фаговых частиц, должен обладать достаточной стабильностью. Эти и многие другие проблемы, связанные с недостаточной эффективностью экспрессии гибридных генов в системе фагового дисплея, должны решаться с использованием общих подходов к оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных системах, рассмотренных в первой части книги. С помощью подходящих бактериальных штаммов и условий культивирования можно решать многие из этих проблем. Тем не менее, при отборе ферментов с требуемыми свойствами чаще всего приходится пользоваться оригинальными подходами, к счастью опирающимися в своей основе на общие принципы, которые будут кратко перечислены ниже.
