Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Отбор по связыванию с лигандом. Анализ популяции фаговых частиц на наличие на их поверхности белков, взаимодействующих с ингибитором исходного фермента или моноклональными антителами (шАЬ) соответствующей специфичности, может быть как самостоятельной задачей, так и хорошим мето-
дом исследования качества самой фаговой клонотеки. Фаги инкубируют с иммобилизованным ингибитором или шАЬ и элюируют тем же ингибитором в условиях пониженного его сродства к ферменту, например, в результате изменения значений pH. Отношение числа связавшихся фаговых частиц из клонотеки к количеству связавшихся частиц из популяции ^модифицированных фагов рассматривают как меру правильности фолдинга гибридного фермента, а также качества фагового дисплея вообще. Отбор по степени связывания лиганда оказывается полезным при попытках получения методами белковой инженерии дополнительных сайтов связывания в рекомбинантном ферменте с целью осуществления аллостерической регуляции его активности. Такие модифицированные молекулы могут использоваться в качестве биосенсоров для количественной идентификации конкретных лигандов.
Отбор на основании ферментативной активности. Отбор частиц фагового дисплея на основании ферментативной активности исследуемых гибридных белков требует от экспериментатора большего искусства по сравнению с только что рассмотренным. В этом случае необходимо найти способ, который бы учитывал способность фермента метаболизировать субстрат и особенности его выделения из сложной смеси фаговых частиц.
В простом случае, когда объектом поиска является мутантный фермент с измененной субстратной специфичностью, его можно отделить от остальных производных на колонке с иммобилизованным аналогом субстрата, который должен специфически распознаваться этим, но не исходным ферментом. Отбор с использованием ингибиторов, полученных на основе аналогов субстратов, был успешно применен, в частности, для мутантных производных нуклеазы стафилококков с целью изменения ее специфичности. Нуклеаза стафилококков является Са2+-зависи-мой фосфодиэстеразой, гидролизующей ДНК с небольшим предпочтением к остаткам тимидина на 5'-конце расщепляемой связи. Из клонотеки, содержащей мутагенизированный с помощью ПЦР ген нуклеазы, выделяли ферменты с повышенным сродством к иммобилизованным олигонуклеотидам, построенным из фосфоротиоатных аналогов тимидина или гуанидина. Такие производные олигонуклеотидов устойчивы к действию данной нуклеазы. Некоторые производные нуклеазы, выделенные с помощью этого метода на тимидиновом субстрате, обладали аналогичной удельной активностью, что и фермент дикого типа, тогда как удельная активность мутантных ферментов с повышенным сродством к олиго(С) была в 10 раз ниже. Одновременно проис-
ходило ожидаемое изменение специфичности производных фермента [98].
Поскольку многие ферменты обладают большим сродством к субстратам в переходном состоянии, именно иммобилизованный аналог субстрата, имитирующий его переходное состояние, используют в качестве лиганда при аффинной хроматографии. В основе этой концепции лежит одно из главных положений теории ферментативного катализа, впервые выдвинутое JI. Полингом, в соответствии с которым активный центр фермента должен быть в большей степени комплементарен форме субстрата, находящейся в переходном состоянии, т.е. претерпевшей предварительные структурные перестройки на пути превращения в продукт реакции, но не в основном исходном состоянии [99].
Третьим широко используемым способом отбора является введение аффинной метки в активный центр фермента в составе фаговой частицы с последующим отбором меченых частиц. Разновидностью этого подхода является использование субстрата, метаболизируя который, фермент совершает самоубийство, так как в результате ферментативной активации субстрат необратимо модифицирует активный центр фермента.
Отбор in vivo. Все рассмотренные выше подходы к отбору белков и пептидов, экспонированных на поверхности фаговых частиц, были основаны на применении селектирующих лигандов вне организма, т.е. in vitro. Несмотря на большой, во многом уже реализованный потенциал этой группы методов, их использование имеет весьма существенные ограничения. Например, для лечения многих сердечно-сосудистых заболеваний, включая тромбозы, атеросклероз, воспаление при аутоиммунных реакциях организма, а также процессы атерогенеза в опухолях, необходима адресная доставка лекарственных средств к клеткам эндотелия кровеносных сосудов. Как и во всех других подобных случаях, избирательное воздействие на эндотелий невозможно без использования макромолекулярных мишеней, специфичных для такой ткани. При этом характер экспрессии генов в клетках эндотелия зависит от их локализации в организме, т.е. органной принадлежности. Поиск молекулярных мишеней эндотелия затруднен невозможностью сохранения специфической экспрессии его генов в условиях культивирования in vitro. В культуре клеток или ткани эндотелий утрачивает свои специфические свойства. Все это относится не только к эндотелию, но и ко многим другим специализированным (высокодифференцированным) тканям организма. Такое состояние дел стимулировало поиск маркеров непосредственно в живом организме.
