Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
При конструировании клонотеки пептидов прежде всего синтезируют два комплементарных друг другу олигонуклеотида, образующих после отжига двухцепочечную молекулу, центральная часть которой кодирует собственно пептиды (рис. 46, а), а выступающие по концам одноцепочечные участки комплементарны “липким” концам вектора, получающимся под действием соответствующей рестриктазы (рис. 46, б).
Для кодирования аминокислот пептидов используют вырожденные кодоны вида NNK или NNS, которые включают все четыре нуклеотида (N) в первом и втором положениях, G или Т(К), а также G или C(S) в третьем положении. При таком подходе информация о всех 20 аминокислотах и одном стоп-кодоне заключена в 32 различных кодонах NNK и NNS, а не в 64, как это имеет место в случае природного генетического кода.
В процессе синтеза вырожденных олигонуклеотидов, кодирующих исследуемые пептиды, на каждой стадии используют индивидуальные нуклеотиды для кодонов инвариантных аминокислот, фланкирующих вариабельный участок пептида, а также эк-вимолярные смеси нуклеотидов для участков, кодирующих случайные последовательности. Образовавшийся в итоге набор вы-
а Вырожденный gggct (nnk) 6ggggccgctg
олигонуклеотид TGCCCCGA (NNM) 6ccccggc
5 Вектор ^ ^
— CTATTCTCACTCGGCCGACgTGGCCTGGCCTCldGGGCCGAAACTGTTGAA —
— GATAAGAGTGAGCCGGCjfGGACCGGACCGGAGACCCCGGCTTTGACAACTT —
в Вектор 1
со вставкой I
— CTATTCTCACTCGGCCGACG(gGGCT (NNK) gGGGGCCGmbGGCCGAAACTGTTGAA —
— GATAAGAGTGAGCCGGCjTGCCCCGA (NNK) 9CCCCGGCpACCCCGGCTTTGACAACTT —
Гибридный
pill nh2-a DGAX6 GAAGA
E T V E —
Отсутствует у pill дикого типа
Рис. 46. Создание рекомбинантного вирусного генома, содержащего вставки вырожденных олигонуклеотидов, для получения клонотеки эпитопов [95а]
Двухцепочечный олигонуклеотид (а), содержащий вырожденные кодоны NNK и те же самые сайты рестрикции в составе линкеров, лигируют с ДНК вектора Fuse5 (б), расщепленного рестриктазой Sfil, с образованием рекомбинантного генома (в), который направляет синтез гибридного рекомбинантного белка (г), содержащего на N-конце указанную аминокислотную последовательность
рожденных олигонуклеотидов далее клонируют в виде одноцепочечных фрагментов в соответствующих сайтах гена белка оболочки бактериофага в составе фагового вектора или фазмиды. Альтернативно для такого набора олигонуклеотидов (химически или с помощью ПЦР) синтезируют комплементарные цепи с включением инозина в вариабельные участки, поскольку его остатки, как известно, спариваются с основаниями С и Т матрицы, что облегчает образование правильных дуплексов между соответствующими олигонуклеотидами. Образующиеся двухцепочечные олигонуклеотиды в случае необходимости обрабатывают требуемыми рестриктазами и клонируют в фаговом векторе. Итоговые рекомбинантные молекулы (см. рис. 46, в) ДНК вводят в бактериальные клетки, получая ~109 трансформантов на 1 мг рекомбинантной ДНК, образовавшиеся фаговые частицы размножают в бактериях и после очистки анализируют на присутствие рекомбинантных пептидов (см. рис. 46, г), способных взаимодействовать с исследуемыми рецепторами в белках их вирионов.
Число индивидуальных фаговых клонов в клонотеке является определяющим для ее использования. Например, клонотека, включающая все возможные гексапептиды, должна содержать 64 млн (206) разных шестичленных аминокислотных последова-
тельностей, кодируемых ~1 млрд (326) различных гексакодонов (32 - число кодонов, с помощью которых можно закодировать любую из 20 аминокислот с использованием кодонов NNK или NNS). Для решения такой задачи необходимо получать очень большие клонотеки, содержащие, по крайней мере, 2 • 108 - 3 • 108 индивидуальных независимых клонов, а величина 109 в настоящее время является верхним пределом для числа индивидуальных клонов клонотеки, которую еще можно практически использовать.
Исходя из этого, можно заключить, что максимальная длина пептидов, включающих в себя все возможные сочетания 20 аминокислот, с которыми возможно работать с помощью клонотек пептидов, составляет шесть аминокислотных остатков. Тем не менее, следует иметь в виду, что клонотека 15-членных пептидов того же размера (2-3 • 108 клонов) будет содержать больше разнообразных гексапептидов, чем рассмотренная выше клонотека 6-членных пептидов. Кроме того, поскольку лишь ограниченное число аминокислотных остатков в пептиде действительно определяет его биологическую активность, клонотека 15-членных пептидов может оказаться представительнее клонотеки более коротких пептидов с тем же числом клонов.
Для того, чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (шАЬ) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стреп-тавидина (рис. 47). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низкими значениями pH, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках, и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии.
