Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
друг на друга происходит предпочтительнее, чем соответствующих гетеродуплексов. Проблему решают применением в рекомбинировании предварительно полученных фрагментов одноцепочечной ДНК разных цепей объединяемых генов. При другом способе решения этой проблемы в объединении используют фрагменты ДНК, созданные не случайным расщеплением ДНКазой I, а с помощью рестриктаз, причем ДНК разных генов инкубируют с различными рестриктазами. В таком случае гомодуплексы из фрагментов одного и того же гена образуются с той же высокой частотой, однако элонгируются только гетеродуплексы с 5'-вы-ступающими одноцепочечными участками при несовпадении расположения сайтов рестрикции на двух объединяемых последовательностях ДНК.
Процесс ступенчатого удлинения олигомеров (staggered extension process (StEP)). Этот простой и эффективный метод часто используют для осуществления рекомбинации между двумя или несколькими ДНК-матрицами in vitro с помощью модифицированной ПЦР [86]. Две или несколько ДНК-матриц отжигают с набором коротких олигонуклеотидных праймеров в одной реакционной смеси, которые взаимодействуют с ДНК в случайных местах. За этим следуют повторяющиеся циклы денатурации, очень непродолжительного отжига праймеров и их элонгации ДНК-полимеразой. Процесс продолжается до тех пор, пока в реакционной смеси не образуется ПЦР-продукт необходимой длины. Переключение синтеза ДНК с одних матриц на другие, которое происходит в каждом новом цикле ПЦР, в конце концов приводит к образованию набора полноразмерных генов, в которых случайным образом объединены участки исходных генов-матриц.
-------
Рис. 44. Рекомбинирование негомологичных белков [87]
Исходный димер объединяемых генов состоит из генов 1 и 2, объединенных линкером, содержащим подходящие сайты рестрикции; (/) димер фрагментируют ДНКазой I и образовавшиеся концы “затупляют” нуклеазой S1; (2) отбирают фрагменты, размер которых соответствует длине одного гена плюс длина линкера, (3) переводят их в кольцевую форму лигированием по “тупым” концам и (4) линеаризуют с помощью рестриктазы по сайту, который находится в линкере; образующаяся в итоге библиотека генов содержит гибридные молекулы ДНК, кодирующие N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1; (5) химерные гены клонируют в экспрессирующем векторе сразу или после амплификации с помощью ПЦР с использованием по одному из праймеров, комплементарных концам объединяемых генов, которые соседствуют с линкером, и после экспрессии химерных генов получают клонотеку химерных белков
Рекомбинирование фрагментов генов и белков, не зависимое от гомологии. Во всех подходах, рассмотренных выше, необходимым условием обмена последовательностями двух рекомбинируемых генов является наличие между ними протяженных участков гомологии. Для преодоления этого ограничения можно использовать специальный метод, который позволяет получать из двух сильно дивергировавших кодирующих последовательностей клонотеки гибридных генов, объединяющих в себе последовательности исходных генов в разных пропорциях [87].
Работа по созданию таких клонотек начинается с объединения двух генов в виде димера “голова к хвосту”, между которыми находится короткая линкерная последовательность, содержащая нужные сайты рестрикции (рис. 44, стадия 1). Димеры фрагментируют случайным образом, инкубируя их с ДНКазой I, образовавшиеся концы молекул “затупляют” нуклеазой S1, а сами фрагменты ДНК фракционируют по размерам, отбирая молекулы, длина которых соответствует размерам одного из исходных генов (стадия 2). Далее осуществляют внутримолекулярное лигирование этих фрагментов по тупым концам (стадия 3), что сопровождается образованием кольцевых молекул ДНК, которые далее линеаризуют с помощью рестриктаз по последовательности линкера (стадия 4). Итоговые гибридные молекулы ДНК кодируют N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1, которые могут быть синтезированы в виде единой полипептидной цепи в результате экспрессии рекомбинантных генов после их клонирования в составе экспрессирующего плазмидного вектора. При этом, соотношение последовательностей двух объединяемых белков в составе гибридных молекул варьирует в широких пределах.
2.3. Скрининг и отбор белков с требуемыми свойствами
Создание репрезентативных клонотек нуклеотидных и кодируемых ими белковых последовательностей является первым этапом, который необходимо преодолеть при конструировании белков методом направленной эволюции. Следующий важный шаг на этом пути - обнаружение белка с требуемыми свойствами среди большого числа макромолекул, составляющих полученную клонотеку. Имеются три принципиально различающихся стратегии поиска нужного молекулярного объекта: случайный скрининг, улучшенный (facilitated) скрининг и отбор. Подходы, основанные на скрининге, предполагают в оптимальном варианте изучение всех объектов клонотеки. При случайном скрининге,
который является наиболее трудоемким и наименее интеллектуальным подходом, каждый молекулярный объект (в виде клонов) один за другим исследуется на наличие у него требуемых свойств, при этом его выбор из клонотеки происходит “вслепую”, ничем не ограничивается и является случайным перебором.
