Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Улучшенный скрининг становится возможным в том случае, если объекты, составляющие клонотеку, различаются фенотипически, например, по наличию у них потенциальной ферментативной активности. Примером улучшенного скрининга является обнаружение окрашенных бактериальных колоний, что может быть следствием экспрессии в бактериальных клетках искомого фермента. Хотя при таком качественном тесте все равно приходится анализировать все объекты клонотеки, которые будут затеряны среди ненужных представителей (в нашем примере -большого числа неокрашенных бактериальных клеток), улучшенный скрининг существенно облегчает процесс поиска требуемых молекулярных объектов. Тем не менее, эта группа методов, как правило, характеризуется низкими значениями отношения сигнала к шуму, а также имеет место конкуренция (в том числе и неспецифическая) за ресурсы (в частности, компоненты питательной среды или субстрат реакции) со стороны ненужных компонентов клонотеки, что может блокировать проявление фенотипического признака.
В системах, основанных на истинном отборе или селекции, создаются условия, обеспечивающие избирательное сохранение компонентов клонотеки, которые обладают определенными свойствами. Например, при отборе конкретных представителей клонотек на основе микроорганизмов в систему можно ввести селектирующий агент, например антибиотик, в присутствии которого будут выживать лишь те объекты, которые экспрессируют ген устойчивости к этому антибиотику. Поскольку системы селекции обладают наибольшей разрешающей способностью, далее будут подробнее рассмотрены принципы действия некоторых современных вариантов таких систем, которые эффективно используются для получения белковых молекул методом направленной эволюции.
2.3.1. Фаговый дисплей
Метод фагового дисплея, разработанный Г.П. Смитом в 1985 г., представляет собой простую и эффективную систему отбора белков и пептидов с требуемыми свойствами, экспрессированных на поверхности частиц нитевидных бактериофагов [88]. Возможность эффективного использования фагового дисплея
для проведения направленной эволюции белковых молекул определяется наличием в системе прямой связи между аминокислотной последовательностью исследуемого белка и кодирующей ее последовательностью нуклеотидов генома бактериофага, т.е. между генотипом фаговой частицы и ее фенотипом [89]. Это достигается клонированием целевой нуклеотидной последовательности в составе гибридной последовательности, которая, кроме нее, включает ген одного из белков фаговой оболочки. Во время фаговой инфекции в результате экспрессии гибридного гена происходит образование химерного белка, который встраивается в оболочку бактериофага, а исследуемая полипептидная цепь экспонируется наружу фаговой частицы и может быть изучена на предмет наличия у нее определенных свойств. Использование при клонировании различных (например, измененных под действием мутаций) нуклеотидных последовательностей приводит к созданию клонотеки таких последовательностей в составе фаговых частиц и одновременно клонотеки полипептидов, в которой каждый гибридный полипептид не теряет связи с кодирующим его геном. Это дает возможность при необходимости продолжать работу с такой искусственной генетической системой, как на генном уровне, так и с самим очищенным белком, после заражения бактериальных клеток отдельной фаговой частицей и очистки бактериофага.
Процедура отбора требуемой фаговой частицы из клонотеки проста. В том случае, если ведется отбор на способность гибридного белка взаимодействовать с конкретным иммобилизованным лигандом, после инкубации суспензии фаговых частиц с сорбентом несвязавшиеся частицы отмывают, а оставшиеся в комплексе с лигандом бактериофаги после элюирования используют для заражения бактериальных клеток. Амплифицированные таким образом гибридные гены являются исходным материалом в новом раунде мутагенеза и селекции. Эта и некоторые другие возможности отбора будут подробнее рассмотрены ниже.
Бактериофаги. При конструировании клонотек нуклеотидных последовательностей для фагового дисплея чаще всего используют хромосомы нитевидных колифагов М13, fl и fd, а также фагмиды, полученные на их основе. Эти фаги заражают мужские клетки Е. coli через половые ворсинки (F-пили), которые содержат белковые рецепторы, обеспечивающие их сорбцию. Хромосома фагов представляет собой одноцепочечную, кольцевую, ковалентно замкнутую ДНК, которая заключена внутри цилиндрической белковой оболочки, обеспечивающей выживание вирусов в экстремальных условиях: при значениях pH 2,5-11 и темпе-
ратурах до 80°С. Оболочка построена из белков нескольких типов. Основной белок оболочки g8p (5,2 кДа), представленный ~2700 копиями, формирует цилиндр вокруг молекулы ДНК. Верхняя часть цилиндра закрыта белками g7p и g9p (3,6 кДа), присутствующими в пяти копиях каждый. Противоположный конец закрывается пятью молекулами белков g6p (12,3 кДа) и g3p (42,5 кДа), которые обеспечивают адсорбцию фагов на половых ворсинках бактериальных клеток. Полипептидная цепь белка ?3р, часто используемого в качестве носителя при построении клонотек на основе фагового дисплея, состоит из трех доменов, разделенных повторяющимися последовательностями, обогащенными остатками Gly. N-Концевой домен (остатки 1-67) и центральный домен (остатки 87-217), пространственная структура которых определена, обеспечивают инфекционность фаговых частиц [90, 91]. C-Концевой домен (остатки 257-406) удерживает белок в составе оболочки [92].
