Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 133

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 127 128 129 130 131 132 < 133 > 134 135 136 137 138 139 .. 221 >> Следующая

Само по себе создание представительных клонотек и тестирование свойств даже небольших белков со всеми возможными комбинациями аминокислотных остатков является в настоящее время неразрешимой задачей. Исчерпывающая клонотека должна включать полное пространство последовательностей. Как уже упоминалось выше, пространство последовательностей полипептидной цепи определенной длины представляет собой сеть всех теоретически возможных взаимосвязанных аминокислотных последовательностей, в которой каждый узел представляет собой уникальную последовательность аминокислот. Пространство последовательностей для белка в п аминокислотных остатков (а.о.) будет содержать ~20" членов, т.е. в пространстве последовательностей даже небольшого белка длиной в 200 а.о. будет заключено ~20200 разных макромолекул, а это значение превышает число атомов в видимой части вселенной, которое оценивается ~1079.
Большой по объему задачей представляется даже исследование влияния одиночных замен аминокислотных остатков полипептидной цепи известного белка длиной в 200 а.о., так как здесь количество возможных вариантов составит 3800, а при необходимости изучения в белке еще и всех двойных замен -~7,3 • 106. Однако, как уже упоминалось, для радикального изменения каталитических свойств ферментов, как правило, необходимы множественные замены аминокислотных остатков их полипептидных цепей.
В настоящее время неизвестны частоты встречаемости белков с заданной вторичной, а тем более третичной структурами, среди набора полипептидов со случайными последовательностями аминокислотных остатков. Поэтому для поиска белковых молекул, обладающих требуемыми свойствами, необходимо использовать клонотеки очень большого размера, в идеале содержащие максимально возможное количество компонентов, с которым еще можно работать экспериментальными методами. Разнообразие в клонотеках нуклеотидных последовательностей, кодирующих исследуемые белки, создается введением в гены случайных мутаций.
2.2. Методы введения случайных мутаций
Рассмотренные подходы к получению сайт-специфических мутаций с помощью олигонуклеотидов позволяют с высокой точностью и эффективностью производить замены отдельных нуклеотидов в строго определенных локусах. Однако чаще всего невозможно предсказать фенотипические последствия мутационных замен отдельных аминокислот в полипептидных цепях белков, и для получения необходимых фенотипических изменений требуется внесение множественных мутаций в определенные участки гена с последующим отбором мутантов требуемого фенотипа. Для решения подобных задач был разработан и эффективно используется метод кассетного мутагенеза.
При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами.
Одной из разновидностей кассетного мутагенеза является способ введения мутаций, основанный на ПЦР с вырожденными праймерами. В этом случае при проведении ПЦР используют праймеры, которые получают введением в определенные положения при их синтезе разных нуклеотидов, что достигается применением на конкретных этапах синтеза не отдельных предшест-
венников, а их смеси, что приводит к одновременному образованию набора олигонуклеотидов.
Внесение множественных мутаций в разные участки полипептидных цепей позволяет при наличии соответствующих эффективных методов отбора получать белки с требуемыми свойствами и уже после этого определять, какие именно аминокислоты придают эти свойства белку. Альтернативным методом определения функциональной значимости отдельных аминокислот в белках является их целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту, например, аланин. Такая последовательная замена аминокислот в полипептидных цепях на остатки Ala получила название сканирование аланином. Введение аланина в полипеп-тидные цепи не изменяет их общей конформации, как это имеет место, например, в случае замены на глицин или пролин, и не сопровождается ярко выраженными электростатическими или сте-рическими эффектами. Кроме того, аланин часто встречается в полипептидных цепях и с одинаковой частотой представлен как на внутренних, так и на внешних участках полипептидных цепей белковых глобул. С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты, образующие активный центр ферментов, исследовать участки полипептидных цепей, существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами, изучать структуру эпитопов полипептидных цепей, а также ряд других структурных и функциональных особенностей белков.
Предыдущая << 1 .. 127 128 129 130 131 132 < 133 > 134 135 136 137 138 139 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed