Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
В последнее время была разработана основанная на ПЦР система случайного мутагенеза, которая позволяет преодолевать описанное выше затруднение [83, 84]. Мутагенез проводят в две стадии. На первом этапе ПЦР осуществляют с помощью Taq-ДНК-полимеразы в присутствии ионов Мп2+, что сопровождается ошибочным включением нуклеотидов в синтезируемую ДНК с преобладанием транзиций. Образовавшийся продукт используют в качестве матрицы во второй ПЦР, при проведении которой в реакционную смесь добавляют дезоксиинозинтрифосфат (dITP), который, как известно, образует комплементарные пары с пири-мидинами С и Т матрицы. В итоге происходит коррекция спектра мутаций, образовавшихся в первом раунде, в сторону образования трансверсий. Если при использовании обычных подходов имеет место образование 74,8% транзиций и только 25,2% трансверсий, то в случае системы Mn2+-dITP доля трансверсий возрастала до 41,7%, что позволяло повысить число возможных замен а.о. в каждом участке мутагенизируемых полипептидных цепей более, чем в два раза.
2.2.3. Случайное объединение гомологичных
и негомологичных участков генов
Случайное объединение гомологичных мутантных фрагментов ДНК, в сумме составляющих всю структурную часть гена (DNA shuffling), с последующей экспрессией собранных таким путем генно-инженерных конструкций является еще одним распространенным и эффективным способом повышения разнообразия пула белковых молекул, используемых в направленной эволюции [85]. Реализацию этого подхода осуществляют в два этапа. Прежде всего, структурную часть гена в составе экспрессирующего вектора подвергают мутагенному воздействию, получая популяцию молекул ДНК, содержащих случайные мутации. Мутантные белки (следовательно, и кодирующие их гены) подвергают отбору на наличие в них определенных свойств (см. ниже). На втором этапе отобранные мутантные гены, которые кодируют требуемые белки, фрагментируют ДНКазой I и объединяют друг с другом in vitro с помощью ПЦР в отсутствие праймеров (рис. 43, а). Вместо инкубации с ДНКазой I для фрагментации генов также применяют ПЦР со случайным праймированием, осуществляемым короткими праймерами, которые обладают несколькими местами посадки в гене (рис. 43, б).
Возможность правильной сборки гена из таких фрагментов ДНК определяется тем, что в процессе фрагментации образуют-
Повторение
операции
5' — 3'
---------------- 3'
Случайный мутагенез,
скрининг
Отобранные клоны
1
Сборка полноразмерных молекул и амплификация
3' 5'-
5' 3''
| Клонирование и скрининг Отобранные клоны
Синтез со случайно отжигающейся затравкой
5' —--------
3•
3•
5'
I Удаление j матричной ДНК
-*— —
—к—
3'
5'
ся перекрывающиеся молекулы ДНК, в сумме представляющие всю исходную молекулу, которые во время ПЦР на стадии отжига находят комплементарные гомологи. При этом из-за случайного характера проведенного мутагенеза на данной стадии с высокой вероятностью образуются гетеродуплексы. Мутации, присутствующие в гетеродуплексах, фиксируются при достройке выступающих одноцепочечных участков ДНК ДНК-полимеразой, а также при последующих циклах ПЦР. После такой перетасовки мутантных частей и экспрессии гибридных генов среди новых мутантных ферментов проводят второй цикл отбора белков с требуемыми свойствами, что, как правило, позволяет улучшить параметры исходных белков.
При случайном объединении ДНК фрагментированных генов одного семейства (family shuffling) фрагментации и последующему объединению подвергают последовательности гомологичных генов, принадлежащих одному семейству. При этом подходе случайному объединению в одной молекуле ДНК подвергаются фрагменты ДНК, последовательности которых ди-вергировали в процессе филогенетического развития организмов и, судя по значительной гомологии, происходят от общего гена-предшественника. Технически процесс объединения фрагментов ДНК в данном случае не отличается от только что описанного.
Основной проблемой, с которой приходится сталкиваться при объединении фрагментов ДНК разных генов одного семейства, является низкий выход рекомбинантных фрагментов ДНК: из двух генов, гомология между которыми составляет 80%, образуется менее 1% рекомбинантных молекул. Возможное объяснение этого явления заключается в том, что в данной системе образование гомодуплексов при первом отжиге фрагментов ДНК
Рис. 43. Случайное объединение гомологичных мутантных фрагментов ДНК (DNA shuffling) [85]
Получение клонотек случайных последовательностей и их направленную эволюцию проводят в два этапа: 1) исследуемую последовательность нуклеотидов подвергают случайному мутагенезу и отбору на основании свойств кодируемого этой последовательностью белка, 2) популяцию отобранных последовательностей фрагментируют случайным образом с помощью ДНКазы I (а) или методом ПЦР с короткими случайно отжигающимися праймерами (б) и перекрывающиеся фрагменты объединяют друг с другом с помощью ПЦР без праймеров; образовавшимися в итоге полноразмерными молекулами ДНК трансформируют компетентные клетки, среди которых проводят отбор по фенотипу на основании свойств исследуемого рекомбинантного белка
