Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
По способам получения клонотеки пептидов разделяются на три группы [95а]. К первой группе можно отнести клонотеки химически синтезированных пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые применяют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях. Клонотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге очищенных препаратов рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего применяют рецепторы, ассоциированные с мембранами.
Кроме того клонотеки пептидов могут быть получены с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к
растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. переводят их в растворимую форму. Третий подход к конструированию клонотек пептидов стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования клонотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков.
Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, клонотеки пептидов, полученные генно-ин-женерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Недавно сделанные наблюдения позволяют рассматривать клонотеку пептидов одновременно и в качестве клонотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образующиеся между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую клонотеку пептидов - как клонотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.
Клонотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых (см. ниже) присутствуют дополнительные последовательности аминокислот. В наиболее хорошо разработанной системе, позволяющей конструировать клонотеки пептидов генно-инженерными методами, используют не-
Олигонуклеотидная
вставка
pIII-Эпитоп
pVIII-Эпитоп
Олигонуклеотидная
вставка
Рис. 45. Экспрессия пептидных эпитопов на поверхности оболочки нитевидных колифагов [95а]
Пептидные эпитопы находятся в составе гибридных полипептидных цепей минорного белка pill (а) или основного белка pVIII вирусной оболочки (б). Стрелки указывают положение кодирующих эпитопы олигонуклеотидных фрагментов в геноме бактериофага, а также локализацию самих эпитопов. В составе полипептида рШ (а) показана только одна копия эпитопа (на самом деле их число достигает 4-5)
большой нитевидный колифаг fl и два его белка: основной и минорный белки оболочки pVIII и pill [95а]. In vivo оба белка синтезируются в виде полипептидных цепей с короткими N-концевы-ми сигнальными последовательностями, которые отщепляются сигнальной пептидазой во время их созревания после переноса к внутренней части бактериальной мембраны. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. При этом белок pVIII образует основную оболочку бактериофа-
га, тогда как четыре или пять молекул pill ассоциированы с концевой частью вириона и обеспечивают взаимодействие вирусных частиц с половыми ворсинками клеток Е. coli (рис. 45). Генно-инженерными методами пептиды соединяют с белками - непосредственно с их N-концевыми последовательностями или на небольшом от них расстоянии. Концевые последовательности большинства белков являются более гибкими и, как правило, экспонируются на поверхности глобулы, что позволяет получать гибридные рекомбинантные белки без существенного нарушения их основных свойств, а также делает интегрируемые пептиды доступными для распознавания извне. Кроме того, в таком положении и пространственная структура самих пептидов испытывает меньшее влияние белка-носителя. В ходе экспериментов было установлено, что введение чужеродных пептидов в N-концевую часть белка pill не оказывает существенного влияния на жизнеспособность и инфекционность фаговых частиц, тогда как соединение пептидов длиной >5 аминокислотных остатков с N-концевой частью белка pVIII нарушает сборку вирионов. Последнее затруднение можно преодолеть доставкой к месту сборки вирионов молекул белка pVIII дикого типа, синтез которых направляется соответствующим геном вируса-помощника. В этом случае оболочка бактериофага будет содержать как измененные белки pVIII, так и полипептиды дикого типа от вируса-помощника.
