Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
1МГ»
с уже цитированной работой Клинкерта и соавторов [Klinkert et al., 1980].
Прауз и соавторы предложили микромодификацию метода Лорелла. Весь процесс переносят в капилляры диаметром около 1 мм. Агарозу с антисывороткой полимеризуют в капилляре, а раствор антигена наносят на торец столбика геля, как при обычном электрофорезе в трубках. Опыт ведут в стандартном приборе для вертикального электрофореза. Здесь, разумеется, не образуется никаких «ракет», поскольку поперечная диффузия антигена отсутствует, и это повышает чувствительность метода. Измеряют расстояние плоского фронта преципитации от начала геля после прекращения продвижения этого фронта вдоль трубки в связи с исчерпанием антигена. Столбики гелей из серии капилляров выдавливают водой на покрытую агарозой пластинку, выравнивают их там по сетке подложенного снизу трафарета и закрепляют несколькими каплями расплавленной агарозы. В таком виде все столбики геля одновременно окрашивают. Удается обнаружить до 10-9 мкг белка-антигена при объемной концентрации неразбавленной антисыворотки в агарозе около 0,1%.
Поскольку расстояние миграции фронта преципитации определяется только исходным количеством антигена, а объем его раствора роли не играет, то можно к каждому капилляру присоединить резервуар емкостью, например, в 5 мл и заполнить его разбавленным раствором антигена. Таким способом (разумеется, за счет увеличения продолжительности процесса) можно определить количество антигена в растворе с концентрацией 2ХЮ"5 мкг/мл [Prause et al., 1978].
Собственно говоря, электрофорез в методе Лорелла нужен только для того, чтобы заставить молекулы антигена выходить из лунки и двигаться по пластинке с иммобилизованными в агарозе антителами. Того же результата можно добиться за счет действия капиллярных сил. Недавно Глэд и Крабб описали систему иммунокапиллярной миграции взамен «ракет Лорелла». Антитела ковалентно присоединяли на полоску CNBr-активи-рованной целлюлозы. На дно пробирки наливали фиксированный объем (0,3 мл) раствора антигена и опускали туда один конец полоски. Жидкость поднималась вверх по полоске; при этом фронт антигена отставал за счет связывания его молекул с закрепленными на целлюлозе антителами. Положение этого фронта после окончания эксперимента легко установить, вымачивая полоску в растворе антител той же специфичности, но ферментативно или радиоактивно меченных. Поскольку концентрация раствора антигена в пробирке в ходе опыта не меняется, то нет необходимости дожидаться полного перехода всего этого раствора на целлюлозу. Можно фиксировать стандартный уровень, до которого должен каждый раз подниматься фронт жидкости, и проводить калибровку по концентрации антигена в растворе [Glad, Crubb, 1981].
Глава 5
ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
МЕТОД КЛАРКА И ФРИМЕНА
Этот метод количественного двумерного, или, как его чаще называют, «перекрестного» иммуноэлектрофореза является комбинацией рассмотренных выше методов [Clarke, Freeman, 1967]. Сначала в первом направлении смесь белков-антигенов разделяют обычным электрофорезом в агарозе (или ПААГ). Затем следует электрофоретическая миграция разделившихся антигенов в перпендикулярном (втором) направлении. Миграция идет в геле агарозы, смешанной с полифункционал ьной антисывороткой против исходной смеси антигенов. Каждый белок-антиген во втором направлении мигрирует независимо от других и образует зоны преципитации, подобные «ракетам Лорел-ла», но более широкие у основания и напоминающие обычные хроматографические пики. Эта форма пиков обусловлена тем, что миграция начинается не из резко очерченной лунки, заполненной одинаковым по всему ее объему раствором антигена, а из более или менее размытой белковой зоны, образовавшейся в результате электрофореза в первом направлении.
Замечательно, что два антигена, оказавшиеся в одной зоне, т. е. не разделившиеся в ходе первоначального электрофореза, как правило, легко обнаруживаются в процессе электроиммун-ного анализа во втором направлении. Соответствующие пики преципитации, накладываясь друг на друга, как бы просвечивают один через другой, поэтому, если они не совпадают в точности по высоте и форме, их можно не только различить, но и обмерить (рис. 38). Различие двух пиков по высоте и форме может быть обусловлено различием содержания антигенов в общей белковой зоне, неодинаковостью концентраций специфических для них антител в антисыворотке и, наконец, разницей эквивалентных отношений концентраций антигенов и антител, обусловливающих положения зон преципитации. Если же положения белковых зон после электрофореза для двух антигенов, не совпадают, то их пики оказываются соответственно сдвинутыми один относительно другого, что еще больше облегчает их идентификацию.
Изображенная на рис. 38 картина получена в результате перекрестного электрофореза сыворотки крови человека. Она достаточно сложна, содержит несколько десятков пиков, представляющих различные сывороточные белки, однако «расшифровать» ее не трудно. Этому способствуют и хорошо заметные на рисунке различия интенсивностей окрашенных пиков, обусловленные разницей в содержании антигенов в смеси и специфических к ним антител в антисыворотке. Механизм образования линий преципитации здесь точно такой же, как в методе Лорел-
