Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 67

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 140 >> Следующая

Электрофорез ведут в течение 3—18 ч в зависимости от количества антигена и его электрофоретической подвижности в геле при pH 8,6. Напряженность электрического поля должна составлять 10—20 В/см при обязательном охлаждении столика прибора до 4—10°. Выбор pH буфера продиктован стремлением свести до минимума электрофоретическую миграцию антител, заплавленных в гель агарозы.
в ходе электрофореза имеет место следующая цепь событий. Под действием электрического поля первые порции антигена покидают лунку и начинают мигрировать в геле по направлению к аноду. У переднего, полукруглого по форме фронта миграции образуется зона эквивалентного соотношения концентраций антигена и антител, что приводит к выпадению преципитата. Однако с подходом к этому месту новых порций антигена, поступающих из лунки, эквивалентность соотношения нарушается и за счет избытка молекул антигена преципитат растворяется. Это отнюдь не означает разрушения иммунных комплексов— они лишь снова переходят в раствор. В них остаются связанными все антитела, содержавшиеся в данном участке геля, и часть антигенов, поступивших из лунки. Иммунные комплексы если и мигрируют в электрическом поле, то замедленно. Между тем, находящиеся в избытке свободные молекулы антигенов продолжают миграцию с прежней скоростью. Фронт свободных антигенов продвигается дальше, образуя новую, более удаленную от лунки зону эквивалентности и преципитации.
Принципиальное отличие от рассмотренных ранее процессов встречной иммунодиффузии по методу Ухтерлони и иммуноэлектрофореза состоит в том, что здесь концентрация антител в геле остается неизменной, в то время как там в зоне преципитации она увеличивалась за счет встречного потока диффундировавших в геле антител. Этим обеспечивалось поддержание эквивалентного соотношения концентраций в зоне преципитации, а следовательно, и ее неподвижность. Продвижение фронта преципитации в методе Лорелла продолжается вплоть до полного исчерпания запаса антигена, расходуемого на образование иммунных комплексов вдоль всего пути миграции. После этого фронт преципитации останавливается, а его расстояние от лунки может служить мерой количества антигена, исходно в ней находившегося.
В результате тепловой диффузии молекул антигена в обе стороны перпендикулярно направлению электрического поля боковые контуры треков движения антигенов тоже будут отмечены тонкими линиями преципитации, так что образуются сужающиеся кверху (меньше времени для поперечной диффузии) профили, получившие образное наименование «ракет Лорелла» (рис. 36). Высоту «ракеты» принято измерять от середины лунки до наиболее удаленной точки переднего фронта преципитации. Зависимость этой высоты от количества антигена, внесенного в лунку, нелинейна, но хорошо ложится на плавную калибровочную кривую (рис. 37). Ее строят для каждого опыта, отводя 4—5 лунок для известных разбавлений определенной начальной концентрации антигена (первые четыре лунки слева на рис. 36). Ближе к прямолинейной выглядит зависимость квадрата высоты «ракеты» от количества антигена [Mueller, Potter, 1979]. Для количественных определений, вообще говоря, не обязательно вести электрофорез до полного исчерпания антигена в
©
0
Рис» 36. «Ракеты Лорелла* (см* текст)
Рис. 37. Калибровочная кривая для определения количества антигена по* методу Л орел л а
Аг — количество антигена в лунке; Н —высота соответствующей «ракеты»
лунках и прекращения роста ракет. Нужно только позаботиться о том, чтобы калибровочная кривая снималась в строго идентичных условиях и на ней было бы достаточное число точек.
Измерить высоты «ракет Лорелла» зачастую удается без окрашивания, наблюдая их во влажном геле на черном фоне при боковом освещении. Если необходимо, то после отмывки непре-ципитировавших белков агарозный гель можно высушить и окрасить, как было описано для иммуноэлектрофореза.
Концентрации исследуемых растворов антигена, как и исходное разбавление и объемную концентрацию антисыворотки в геле агарозы, приходится подбирать опытным путем, чтобы «ракеты» были достаточно хорошо видны, а их высоты (после исчерпания запасов антигена во всех лунках) лежали в интервале 1—5 см. Такие высоты можно достаточно точно измерить; вместе с тем, электрофорез не занимает слишком много времени. Очевидно, что чем больше отношение концентрации антигенов в лунках к концентрации антител в геле, тем выше будут «ракеты Лорелла». Абсолютные же значения этих концентраций диктуются необходимостью получения четких линий преципитации. В качестве ориентировочных цифр можно рекомендовать загрузку 5 мкг антигена на лунку при внесении в гель неразбавленной антисыворотки до концентрации 2,5% по объему. Если гель предполагается окрашивать, то обе исходные цифры можно уменьшить в 10 раз. Опыты можно ставить в двух вариантах; с полиспецифической антисывороткой для определения количества чистого антигена или с моноспецифической для определения количества данного антигена в смеси с другими.
В качестве примера использования электроиммунного анализа по Лореллу для определения количества антигена (гели-казы II в экстракте Е. coli) можно рекомендовать ознакомиться
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed