Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
p. 3116—3120.
Shen V.f King 7\ C.f Kumar V.t Daugherty iB.— Nucl. Acids Res., 1980, 8, p. 4639—4650.
Showe M, K., Isobe Onorato L,— J. Mol. Biol., 1976, 107, p. 55—69.
Symington J.t Green M.r Brackmann K.— Proc. Nat. Acad. Sci, US, 1981, 78, p. 177—181.
Tow bin H,f Staehelin 7\, Gordon J,— Proc, Nat. Acad. Sci. US, 1979, 76,-p. 4350—4354.
Walter G„ Scheidtmann K-H.t Carbone A. et al.—Ibid., 1980, 77, p, 5197— 5200.
Wasserman E,f Levine L.—J. Immunol, 1961, 87, p. 290—296.
Weiss P. MDel Vecchio V. G.t Burnett /. B.—Anal. Biochem., 1978, 84v p. 512—521.
1 K.A
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ
ВВЕДЕНИЕ
Многие современные методы исследования белков и нуклеиновых кислот базируются на использовании радиоактивных изотопов. Замена одного или даже многих атомов молекулы биополимера их радиоактивными изотопами в подавляющем большинстве случаев практически не изменяет физико-химических характеристик и физиологической активности этих молекул. Вместе с тем, колоссальная чувствительность методов обнаружения радиоактивности позволяет уменьшить количества используемых в эксперименте препаратов до тысячных долей микрограмма. В исследованиях индивидуальных, содержащихся в организме в очень малых количествах белков и нуклеиновых кислот это обстоятельство играет решающую роль. Однако из самого существа метода вытекают два серьезных затруднения в его использовании, могущие служить источниками ошибок при трактовке результатов эксперимента.
Первое затруднение связано с «обезличенностью» радиоактивного излучения. Например, если в результате некоего эксперимента мы регистрируем излучение радиоактивного изотопа углерода, то само это излучение никоим образом не информирует нас о том, находятся ли атомы радиоактивного углерода в молекулах интересующего нас белка или в каких-то посторонних для данного эксперимента примесях. Природа этих примесей зависит не только от способа очистки препарата, но и от метода введения радиоактивности в интересующие нас биополимеры. Если оно осуществляется «естественным» путем биосинтеза в организме животного, которому с диетой или в виде инъекции ввели низкомолекулярные радиоактивные «предшественники», то не во власти экспериментатора проконтролировать все процессы метаболизма, в которых эти предшественники могут быть использованы. Если же радиоактивная «метка» вводится в уже очищенный биологический препарат in vitro химическим или энзиматическим путем, то, помимо возможности побочных реакций, всегда существует проблема полного отделения продукта от использованных в реакции исходных радиоактивных соединений. В связи с этим методам введения радиоактивных изотопов в молекулы биополимеров и способам очистки продуктов такого введения от радиоактивных «загрязнений» будет уделе-
НП ^ШЯТШТРЛКНПР ЯНИМЯНИР.
Вторая, очень существенная, но зачастую недооцениваемая трудность использования радиоактивных изотопов вытекает из того обстоятельства, что, прежде чем трансформироваться в полезную количественную информацию в виде числа импульсов в минуту, регистрация радиоактивного излучения должна пройти через два сложных этапа преобразований. Первый этап связан со способом приготовления образца для счета радиоактивности. В подавляющем большинстве современных методов исследования каждый акт радиоактивного распада трансформируется во вспышку света в специальной среде, именуемой сцинтиллятором. Высокочувствительные приборы — счетчики сцинтилляций — регистрируют именно вспышки света. Такой прием позволил резко увеличить чувствительность регистрации радиоактивности по сравнению с ранее использовавшимися счетчиками излучения, работавшими по принципу ионизации и электрического разряда в газе (счетчики Гейгера, газопроточные счетчики). Последующее изложение почти целиком посвящено использованию сцинтилляционных счетчиков излучения, хотя те области, где сохранили свое значение ионизационные счетчики, тоже будут отмечены. Эффективность преобразования радиоактивного распада в явление сцинтилляции сильно зависит от способа приготовления препарата для счета и от выбора сцинтиллятора. Этим вопросам посвящена отдельная глава.
Второй важный этап — это регулировка, или, как говорят, «настройка» самого счетчика излучения. Современные сцинтил-ляционные счетчики предоставляют экспериментатору широкие возможности выбора оптимального режима работы прибора в соответствии с используемым изотопом, способом приготовления препарата, необходимостью коррекции неустранимых факторов, влияющих на адекватность счета (хемолюминесценции, «тушения сцинтилляций»), возможностью независимого просчета радиоактивностей двух различных изотопов, входящих в состав препарата, и т. д. Выбор режима осуществляется путем вариации ряда параметров работы сложных электронных устройств, которыми оснащены современные счетчики излучения. Серьезное знакомство с функционированием этих устройств требует, к: сожалению, весьма специальной радиотехнической подготовки. Вместе с тем, экспериментатор-биохимик, как правило, не может целиком доверить выбор режима инженеру, обеспечивающему эксплуатацию счетчика, так как здесь многое зависит от понятных только экспериментатору особенностей препарата.
