Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
МЕТОД НАЛОЖЕНИЯ ПОЛОСЫ ПААГ НА ГЕЛЬ АГАРОЗЫ
Разделение антигенов в первом направлении путем электрофореза в геле агарозы базируется, в основном, на различии электрических зарядов белков, входящих в состав смеси, так как торможение миграции за счет трения в крупнопористом геле агарозы существенной роли не играет. Между тем, в ряде случаев белки-антигены желательно разделять по их размерам. Для этой цели электрофорез в первом направлении проводят в ПААГ.
Такой вариант был использован при иммунохимическом исследовании мембранных белков шпината и хламидомонады [Chua, Blomberg, 1979]. Эти белки растворяли с помощью ДДС-Na; электрофорез вели тоже в ПААГ с ДДС-Na. В ходе электрофореза во втором направлении до вступления в гель агарозы с антисывороткой антигены должны, как уже указывалось, освободиться от ДДС-Na. Для этой цели полоску ПААГ заплавляли в агарозу с добавлением 1% дезоксихолата натрия (ДОХ-Na), а затем на пути антигенов помещали еще и полоску промежуточного геля агарозы, содержащую 1,5% неионного детергента Lubrol РХ. По-видимому, этот детергент, подобно Тритону Х-100, вытесняет ДДС-Na из комплекса с белком и связывает его в смешанные мицеллы. За полоской с Lubrol РХ следовал гель агарозы, содержащий антитела.
Назначение ДОХ-Na — способствовать выходу белков из ПААГ в агарозу. При pH 8,6 ДОХ-Na заряжен отрицательно и мигрирует через полоску ПААГ в направлении анода. Образованию иммунного комплекса он не мешает. В гель агарозы с антителами был введен еще и полиэтиленгликоль в концентрации 4%. Замечено, что он способствует иммунопреципитации и в несколько раз увеличивает чувствительность метода.
Недавно было показано, что ДДС-Na в достаточной степени отмывается из полоски ПААГ смесью изопропанол—CHsCOOH— вода (25 : 7 : 68) в течение ночи. Разделившиеся белки при этом фиксируются, так что полоску можно хранить до начала электрофореза во втором направлении длительное время. Более того, белки одновременно окрашивали, добавляя в указанную смесь
CBB R-250 до концентрации 0,2%, а затем отмывали тем же раствором. Оказалось, что все это не мешает проведению электрофореза в перпендикулярном направлении (в 1%-ной агарозе с антисывороткой) —под действием электрического поля осажденные белки вновь растворялись, мигрировали в агарозу и успешно образовывали пики преципитатов [Kessler, 1981].
На стыке гелей ПААГ и агарозы в силу заметного различия степени эндосмоса может иметь место смазывание линий иммунопреципитации и искажение ее картины, поэтому используют специальный метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы. Последний формируют из двух частей. У края пластины, который впоследствии будет обращен к катоду, заливают слой геля агарозы без антисыворотки с таким расчетом, чтобы он был на несколько миллиметров шире, чем полоса ПААГ, которую предстоит уложить на этот слой вровень с наружным его краем. Вплотную к «пустому» слою агарозы на остальной площади пластины слоем такой же толщины формируют гель агарозы в смеси с антисывороткой. Линия раздела двух слоев должна быть параллельна катодному краю пластины и ориентированной по нему полосе ПААГ. Переносить и накладывать эту последнюю на гель агарозы удобно с помощью упомянутой выше тонкой металлической пластинки. Перед наложением пластинку следует повернуть полосой геля к себе, а затем перевернуть гелем вниз и таким образом уложить его на поверхность агарозы. Электрод-ные фитили накладывают на наружный край полосы ПААГ (катодный) и на противоположный край пластины геля агарозы. В ходе электрофореза во втором направлении антигены из ПААГ переходят в гель агарозы и далее мигрируют в ней, образуя пики преципитации. Различие степени эндосмоса в этом случае никаких проблем не создает.
ВВЕДЕНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНОГО ГЕЛЯ
Выше был описан «тандемный» способ идентификации одного из антигенов в их смеси при перекрестном иммуноэлектрофорезе. Для него требуется наличие чистого антигена. В том случае, когда вместо этого в распоряжении исследователя имеется моноспецифическая антисыворотка для этого антигена, с той же целью можно воспользоваться другим приемом — введением промежуточного геля. Вслед за окончанием электрофореза в первом направлении готовят пластину для второго направления, как было описано в случае обычного перекрестного иммуноэлектрофореза. Затем из слоя геля агарозы с полиспецифиче-ской антисывороткой вырезают и удаляют полосу шириной 1 — 2 см, прилегающую к гелю первого направления. На ее место заливают новую порцию раствора агарозы той же концентрации, но смешанного с моноспецифической антисывороткой.
В ходе электрофореза во втором направлении искомый антиген начнет образовывать пик преципитации сразу по выходе из
Рис. 42. Идентификация пика траисферрина в том же препарате, что и на рис. 41т методом промежуточного геля (см. текст)
геля первого направления, поскольку в промежуточном слое он встретится со специфичной для него антисывороткой. В то же время молекулы всех остальных антигенов будут без задержки проходить через промежуточный слой и основания их пиков преципитации будут лежать на границе промежуточного слоя и остального геля агарозы, содержащего полиспецифическую антисыворотку (рис. 42). Таким образом, искомый антиген явным образом выделится из множества белков-антигенов.
