Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Заметим в заключение, что в тех случаях, когда отдельные пики на сложной картине перекрестного иммуноэлектрофореза возвышаются настолько, что некоторую их часть можно вырезать скальпелем, не затронув другие пики, то открывается воз-можность для полипептщшого анализа содержащихся в них чистых антигенов [Norrild et al., 1977]*
ТАНДЕМНЫЙ ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Идентификацию пика определенного антигена в сложной картине, полученной после перекрестного иммуноэлектрофореза смеси белков, можно осуществить с помощью следующего приема. В полосе геля для электрофореза первого направления вырезают не одну, а две лунки, расположенные друг за другом в направлении миграции белков (с этой целью в шаблоне, изображенном на рис. 39, и предусмотрено по два отверстия в каждой полосе). В одну из лунок вносят исследуемую смесь ан-
тигеноБ, в другую — чистый антиген, пик которого надо отыскать на иммуноэлектрофореграмме. Затем проводят все описанные выше операции перекрестного иммуноэлектрофореза.
Теперь на конечной картине можно отыскать два плавно переходящих один в другой пика, расстояние между которыми точно такое же, как между лунками. Пики могут быть различной высоты (содержание антигена в смеси белков неизвестно), но наличие плавного перехода между ними указывает на то, что оба они обязаны своим появлением одному и тому же белку. Между тем» в одной из лунок находился искомый антиген. Та-ким образом, пик этого антигена обнаруживается и среди множества пиков сложной смеси. Какой из сдвоенных пиков отно-сится к смеси — ясно из того, в каком порядке вносили антиген и исследуемый препарат в лунки. Описанный прием иногда называют «тандемным» перекрестным иммуноэлектрофорезом (рис. 41).
Рис. 41. Идентификация пика трансферрина среди белков сыворотки крови человека методом тандемного перекрестного иммуноэлектрофореза (см. текст)
i — лунка препарата сыворотки; 2 — лунка трансферрина
РАЗЛИЧНЫЕ ВАРИАНТЫ РАЗДЕЛЕНИЯ В ПЕРВОМ НАПРАВЛЕНИИ
Среди таких вариантов в первую очередь можно назвать метод ИЭФ, подробно описанный в части I. Манипуляции с полоской геля агарозы после ИЭФ точно такие же, как в случае электрофореза, если не считать операции перевода геля в веронало-вый буфер путем вымачивания его в двух-трех сменах этого буфера, по 15 мин в каждой. Характерные для ИЭФ узкие белковые зоны при этом немного расширяются за счет диффузии, но наглядность картины перекрестного иммуноэлектрофореза от этого не страдает. Амфолиты можно вымывать не полностью, так как они не мешают иммунопреципитации.
При электрофорезе в первом направлении для улучшения растворимости белков нередко вводят неионный детергент, например 1%-ный раствор Тритона Х-100. Можно вести электрофорез в агарозе и в присутствии ДДС-Na (также только в интересах растворимости, ведь разделение белков по размерам в геле агарозы производить не целесообразно). ДДС-Na при перекрестном иммуноэлектрофорезе под действием поля может переходить в слой агарозы, смешанной с антисывороткой. Этого следует избегать, так как уже упоминалось, что ДДС-Na мешает образованию иммунного комплекса антиген — антитело. В этом случае гель первого направления предварительно вымачивают в буфере, содержащем избыток Тритона Х-100, а иногда его вводят и в состав геля агарозы с антисывороткой. Тритон Х-100 вытесняет ДДС-Na из комплекса с белком и образует с ним смешанные мицеллы, не препятствующие иммунопреципитации.
При рассмотрении методов электрофореза был описан вариант со смещением заряда [Остерман, 1981]. Суть его в том, что в буфер геля одновременно с Тритоном Х-100 вводят дезокси-холат натрия или цетавлон. Два этих детергента имеют ионную природу и могут нести соответственно отрицательный и положительный заряды. Они связываются с Тритоном Х-100, образуя смешанные мицеллы, а через него — и с гидрофобными белками, которые при этом приобретают дополнительный заряд, нередко способствующий их отделению от прочих белков. Такой подход при электрофорезе в первом направлении был использован Бхакди и соавторами при изучении белков, экстрагированных из мембран эритроцитов, методом перекрестного иммуноэлектрофореза. В присутствии дезоксихолата авторы наблюдали заметный сдвиг некоторых пиков по сравнению с контрольным опытом (без дезоксихолата), например для антитрипсина, орозомукоида и третьего белка комплемента [Bhakdi et al., 1977].
Бьеррум для отделения гидрофобных белков использовал другой оригинальный прием. В 1%-ный гель агарозы он вводил гидрофобные матрицы — фенилсефарозу CL-4B или октилсефа-розу CL-4B (фирмы «Pharmacia»), просто смешивая их взвесь с
расплавленной агарозой. В ходе электрофореза в первом направлении гидрофобные белки отставали от гидрофильных за счет своего взаимодействия с матрицей. Выходу их в гель второго направления при перекрестном иммуноэлектрофорезе способствовал Тритон Х-100, который вносили в этот гель до концентрации 1%. Степень гидрофобного взаимодействия белков с матрицей можно еще увеличить, вводя в гель первого направления 0,4 М раствор сульфата аммония. При такой постановке опыта ско* рость миграции будут изменять и слабогидрофобные, и даже в целом гидрофильные белки, на поверхности которых всегда имеются локальные гидрофобные участки.
