Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для приготовления иммуносорбента с помощью глютаральдегида 750 мг белка-антигена растворяют в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7. По каплям с перемешиванием добавляют 3 мл 2,5°/о‘Ного водного раствора глютаральдегида. Через 3 ч при комнатной температуре образуется гель. Его измельчают в гомогенизаторе на небольшой скорости вращения в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 7,3. Суспензию центрифугируют и осадок отмывают тем же буфером с повторными гомогенизациями до прозрачности супернатанта (Л^о<0,01). Потом такую же промывку производят в 0,2 М глицин-НСЬбуфере, pH 2,8 (буфер для элюции антител), и, наконец, в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7, содержащем ОД5 М NaCI (буфер посадки антител). Промытый сорбент смешивают в центрифужной пробирке с антисывороткой или раствором IgG в течение 30 мин, а затем оставляют на 1,5 ч при комнатной температуре. После этого сорбент осаждают центрифугированием (1000 g, 15 мин нри 4°) и промывают тем же забуференным раствором соли до прозрачности супернатанта при 280 нм, Элюцию антител производят тоже в объеме тремя порциями по 5 мл буфера для элюции (pH 2,8) с промежуточными центрифугированиями при 6000 g в течение 15 мин на холоду. Объединенные элюаты для очистки от остатков геля фильтруют через стекловолокнистый фильтр и диализу ют против 0,15 М NaCI. Гель можно регенерировать многократной промывкой 0,2 М фосфатным буфером, pH 7,3, и хранить на холоду с добавкой азида натрия или мертиолата.
Для приготовления иммуносорбента на матрице удобно воспользоваться сефарозой, активированной бромистым цианом, которую выпускает фирма «Pharmacia» («CNBr-activated Sepha-rose 4B). Обработка бромистым цианом создает на поверхности полисахаридной матрицы многочисленные активные центры, легко присоединяющие к себе белки ковалентными связями по их кониевым аминогруппам.
Продажный лиофилизированный препарат BrCN-сефарозы суспендируют « 1 мМ НС1, дают набухнуть в течение 15 мин и промывают тем же раствором от консервирующих добавок. Количество ее можно брать из расчета посадки ¦5 Ю мг белка на 1 мл влажного сорбента с учетом того, что 1 г лиофилизиро-ванной сефарозы набухает до объема 3,5 мл.
После промывки обменник переводят в ОД М раствор NaHC03 (pH 8,3) с 0,5 М NaCl. Высокое содержание соли препятствует неспецифической сорбции белков на матрице сефарозы. В этом растворе обменник в течение 2 ч перемешивают с раствором антигена на качалке при комнатной температуре (или в течение ночи на холоду). Пользоваться для этой цели мешалками не следует ввиду истирания сефарозы. После окончания посадки антигена необходимо заблокировать не занятые им активные центры сорбента. Для этого гель обраба-тывают таким же образом в 1 М растворе этаноламина или 0,2 М растворе глицина при pH 8. Затем избытки белка и блокирующего агента надежно отмывают тем же раствором бикарбоната с солью, потом 0,1 М ацетатным буфером (pH 4) с добавкой 0,5 М NaCl и сиова бикарбонатом.
Приготовленный таким образом иммуносорбент переводят в 0,01 М фосфатный буфер (pH 7) с ОД5 М NaCl, заполняют им небольшую колонку, на которую и наносят антисыворотку или иммуноглобулины, растворенные в том же буфере. Колонку хорошо промывают фосфатным буфером, но с удвоенной концентрацией соли, а иногда и с добавкой 1™2% неионного детергента Тритона Х-100 — все это для снятия неспецифически сорбированных белков. Элюировать антитела с колонки можно ОД М уксусной кислотой или 4,5 М раствором MgCh. Затем следуют завершающие операции нейтрализации, диализа и, если надо, концентрирования раствора очищенных антител. Колонку регенерируют, хорошо промывая посадочным буфером, и хранят на холоду с добавкой ОД % азида натрия.
Если BrCN-активированная сефароза недоступна, то можно приготовить активированный сорбент и в лабораторных условиях на основе сефарозы 4В или сефадекса G-200. Например, к набухшей декантированной сефарозе приливают равный объем воды, погружают в нее термометр и электрод рН-метра, затем при непрерывном перемешивании постепенно добавляют измельченный BrCN из расчета примерно 200 мг на 1 мл исходного объема влажной сефарозы. Не следует забывать, что бромистый циан очень ядовит и работу с ним надо проводить в надежном вытяжном шкафу со всеми необходимыми предосторожностями. Суспензию непрерывно подтитровывают концентрированным раствором NaOH, поддерживая pH около 11. Одновременно, добавляя лед, не дают ей разогреваться выше 20°. Реакция заканчивается за 8—12 мин, о чем можно судить по прекращению закисления раствора. Активированная таким образом сефароза не очень устойчива при щелочных значениях pH. Ее следует незамедлительно перенести на стеклянный фильтр и хорошо промыть упомянутым выше NaCl-бикарбонатным буфером для посадки антигена.
При сравнительной оценке двух описанных вариантов^ приготовления иммуносорбента первый из них привлекает своей простотой и безопасностью, но следует иметь в виду, что глютаровый альдегид сшивает белки-антигены столь тесно, что взаимодействие с антителами происходит только на поверхности частиц раздробленного геля. У сефарозы и сефадекса такое взаимодей-
