Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ствие происходит и внутри крупнопористых гранул сорбента. Иногда для увеличения свободы взаимодействия антител с антигенами последние «сажают» на активированную сефарозу не «вплотную», а через промежуточные линейные молекулы типа этилендиамина или еще более длинные и гибкие углеводородные цепи.
Следует отметить, что впервые иммуносорбенты на матрице были синтезированы и использованы А. Е. Гурвичем и соавторами еще в 1961 г. Диазопроизводное целлюлозы (из обычной ваты) было получено точно таким же способом, какой спустя
16 лет Олвин описал для приготовления столь популярной ныне диазобумаги — антигены ковалентно присоединяли к сорбенту по диазогруппам [Гурвич и др., 1961]. Иммунные сорбенты на основе диазоцеллюлозы с посадкой на нее как антигенов, так и очищенных антител успешно использовались, например, в опытах по изучению генетики иммуноглобулинов [Рохлин и др., 1970].
Для приготовления иммуносорбента необходимо иметь очищенный антиген. Если речь идет о препаративном получении специфических антител, то без этого, очевидно, не обойтись. Однако при очистке относительно небольшого количества антител можно ограничиться разделением исходного клеточного экстракта, например методом электрофореза, и отделять специфические антитела из антисыворотки по их связыванию с зоной (полосой или пятном) антигена в геле. Удобнее для этой цели использовать не сам гель, а его реплику на диазобумаге [Остерман, 1981], где антигены фиксируются ковалентно.
Олмстед фракционировал экстракт из клеток нейробластомы мыши элек* трофорезом по Лэммли и снимал реплику картины разделившихся белков на диазофенилтиоэфир-бумагу (ДФТ-бумагу), Для насыщения не занятых диазогрупп бумагу после этого инкубировали в 10%-ном растворе этанол а мина и промывали буфером (0,05 М Трис-НС1, pH 7,5, с 0,15 М NaCI, 5 мМ ЭДТА, 0,25% желатина и 0,05% NP-40). Затем бумагу инкубировали в запаянном полиэтиленовом мешке в течение 12—16 ч при 37° с неочищенной антисыворот-кой (к тубулину) и промывали тем же буфером. Контрольную реплику с этого же геля обрабатывали аналогично, а затем инкубировали 2 ч при 37° с радиоактивно меченным белком А, избыток которого отмывали буфером, содержащим 1 М NaC] и 0,4% саркозила. Белок А, с которым мы подробно познакомимся ниже, специфически связывается с антителами. Это позволяет методом авторадиографии локализовать на реплике место связывания антител с нужным антигеном (его идентифицируют по положению полосы или пятна после электрофореза). Из рабочей реплики, не обработанной белком А, вырезали соответствующий участок и элюировали с него очищенные таким образом антитела кислым буфером (0,2 М глицин-НС1 pH 2,8). Элюированный материал немедленно нейтрализовали щелочью, разбавляли фосфатно-солевым буфером и концентрировали ультрафильтрацией [Olmsted, 1981].
Получение моноклональных антител е помощью гибридом
В 1975 г. была опубликована пионерская работа Кёлера и Мильштейна, положившая начало новому этапу развития не только иммунологии, но, как ясно теперь, и всей биохимии — этапу, связанному с возможностями массовой продукции и использования моноклональных антител, синтезируемых особыми соматическими гибридными клетками — «гибридомами» [Kohler, Milstein, 1975].
Авторы отобрали линию миеломных клеток (P3-X63 Ag 8), устойчивых к 8-азагуанину благодаря отсутствию у них фермента, способного вести синтез АМФ за счет прямого присоединения рибозофосфата к гипоксантину или гуанину. Этот фермент обеспечивает запасной путь синтеза АМФ в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций такого синтеза заблокирована, например присутствием ингибитора аминоптери-на. На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминопте-рин и тимидин (НАТ-среда), эти миеломные клетки не размножаются.
С другой стороны, авторы использовали клетки селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Клетки селезенки не жизнеспособны в культуре —они тоже не размножаются (тем более на HAT-среде). Далее с помощью убитого вируса Сендай осуществляли соматическую гибридизацию клеток мие-ломы и селезенки. На методе гибридизации с использованием вируса Сендай останавливаться не будем, поскольку его вытеснила описанная ниже более простая техника.
Гибридные клетки (гибридомы) отбирали по их способности размножаться на НАТ-среде. Присущая клеткам миеломы способность к быстрой пролиферации в этом случае восстанавливалась за счет привнесения клетками селезенки упомянутого фермента запасного пути синтеза АМФ. Этот этап селекции гибридных клеток играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации. Достоверность получения гибридом была подтверждена не только фактом их пролиферации на селективной среде, но и прямым анализом кариотипа этих клеток: было обнаружено почти суммарное число хромосом «родителей». Методом гемолиза было показано, что эти гибридомы образуют антитела к эритроцитам барана. Более того, путем селекции удалось отобрать такие штаммы гибридом, которые выделяли в питательную среду только эти «селезеночные» антитела и не синтезировали иммуноглобулинов миеломного происхождения. Использовав изначально мышей линии BALB, авторы смогли путем инъекции отобранных таким образом гибридом мышам этой же линии стимулировать развитие у них злокачественных новообразований, ведущих массированный синтез антител к эритроцитам барана.
