Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
КЛЕТКИ МИЕЛОМЫ И ГИБРИДОМЫ
Рассмотренные замечательные результаты тонких исследований строения иммуноглобулинов и особенно механизмов их биосинтеза в плазмацитах вряд ли были бы возможны, если бы не одно крайне благоприятное для исследователей обстоятельство. Нормальные лимфоидные органы слишком гетерогенны по своему клеточному составу, чтобы предоставить подходящий материал для таких исследований. К счастью, была обнаружена замечательная модельная система, созданная самой природой. Путем последовательных трансплантаций у мыши можно образовать миеломную опухоль, состоящую целиком из плазмацитов, к тому же, в отличие от нормы, интенсивно пролиферирующих (делящихся).
Каждая опухоль — результат многократного деления одной исходной неопластической клетки, поэтому миелома представляет собой клон плазмацитов, секретирующих один-единственный гомогенный иммуноглобулин. На этих опухолевых клеточных линиях и был изучен синтез различных иммуноглобулинов (различие определяется специфичностью исходной клетки).
Новые колоссальные возможности для иммунохимических исследований появились в последние годы, когда было обнаружено, что соматические гибридные клетки, полученные от слияния in vitro клеток миеломы с другими клетками-продуцентами антител, наследуют от первых способность пролиферировать, а от вторых — способность к синтезу специфических для них антител. Таким образом, миеломные клетки передают гибриду свою способность делиться и вести интенсивный синтез иммуноглобулинов, в то время как генетическая информация для этого синтеза поступает от обеих клеток — миеломной и ее партнера по гибриду. Такие гибридные клетки («гибридомы») могут размножаться in vitro, вырабатывая большие количества антител. Их можно размножить и путем трансплантаций в организме мыши. Мало того, удается отобрать такие исходные варианты миеломы или такие продукты гибридизации, что синтез собственных мие-
ломных иммуноглобулинов оказывается заблокированным и вся «миеломная» продуктивность выражается в массированном синтезе интересующих исследователя моноклональных, т. е. совершенно одинаковых не только по своей специфичности, но и по первичной структуре, антител. Трудно переоценить значение этого открытия для развития иммунохимии и исследовательских методов на ее основе. Подробнее методы получения гибридом и моноклональных антител рассмотрены ниже.
ПОЛУЧЕНИЕ ИММУННОИ СЫВОРОТКИ И ОЧИСТКА АНТИТЕЛ
Иммунизация кролика
Иммунизация в лабораторных условиях начинается с введения в организм подопытного животного раствора антигена. Самое детальное описание не может заменить практического освоения этой процедуры под руководством опытного оператора. Здесь надо показывать, а не рассказывать. Поэтому следующие замечания имеют целью только обрисовать общую картину соответствующих манипуляций, с тем чтобы читатель, никогда их не наблюдавший, мог составить себе хотя бы приближенное представление об используемых здесь приемах.
Кролик чаще других лабораторных животных используется в роли донора иммунной сыворотки. Имея в виду круг проблем, рассматриваемых в этой книге, ограничимся случаем выработки антител против чисто белковых антигенов. Получение иммунной сыворотки против пептидов и низкомолекулярных химических соединений (гаптенов) требует предварительной конъюгации этих антигенов с белком, для чего обычно используют бычий сывороточный альбумин. Конъюгацию осуществляют с помощью глютарового альдегида, карбодиимидов, дифтор динитробензол а и других бифункциональных агентов. Для пептидов, например, подробное описание конъюгации и иммунизации можно найти в одной из недавних работ [Walter et al., 1980].
Кровь у кролика удобно отбирать из крупной вены, идущей вдоль края уха. Тем же путем можно вводить антиген, если иммунизацию проводят непосредственно в кровоток. Шерсть можно не сбривать, но для раздражения уха следует потереть его ватным тампоном, смоченным бензолом или ксилолом, а затем смыть спиртом. Стерильную иглу калибра 22 или 25 вводят по направлению тока крови. Кролика во время этих операций можно уложить на спину и привязать за лапы к примитивному станку— наклонно стоящей доске с треугольным вырезом для головы. Многие кролики позволяют провести отбор крови из ушной вены, спокойно сидя на коленях у оператора. Отбирают кровь чеоез резиновую трубочку, надетую на иглу, иногда с подсосом. При введении в вену белкового раствора из шприца подачу жидкости осуществляют медленно, в течение примерно 5 мин.
Возможны различные варианты иммунизации через кровоток. Например, вводят 0,5%-ный раствор белка три раза в неделю, увеличивая объем инъекции от первой к пятой неделе в следующем порядке: 0,5; 1,0; 1,5; 2 и 3 мл. Кровь берут на 8-й день после последней инъекции. Иногда в ходе иммунизации кролик погибает. Кроме того, интенсивность иммунного ответа у разных особей различна. Ввиду этого антиген следует вводить параллельно трем—пяти животным.
Более надежна иммунизация посредством подкожных инъекций. Опубликовано множество прописей, и цитировать их нет смысла. Каждая иммунологическая лаборатория имеет свой опыт и традиции в этом вопросе. При первой инъекции к раствору антигена добавляют равный объем полного адъюванта Фрейнда (см. ниже).
