Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Используется и такая процедура фракционирования: антисыворотку подкисляют уксусной кислотой до рн 5,5, затем добавляют СА до 33% от насыщения, выдерживают 18 ч на холоду, центрифугируют и осадок отбрасывают. В этих условиях IgG остается в растворе, из которого его осаждают, увеличив концентрацию СА до 50% от насыщающей. Осадок промывают тем же раствором СА, перерастворяют и диализуют против нейтрального фосфатного буфера.
Из суммарной фракции глобулинов IgG отделяют хроматографически с помощью ДЭАЭ-целлюлозы, DEAE Sephacel или ДЭАЭ-сефадекса А-50. Колонку с ионообменником уравновешивают 0,01—0,0175 М фосфатным буфером, pH 6,5—6,6. В этом же буфере наносят и элюируют глобулины. IgG не адсорбируется на колонке и выходит в первых порциях элюата. Остальные глобулины, в том числе и прочие иммуноглобулины, задерживаются ионообменником. Их можно затем поочередно элюировать. Например, IgA снимают с колонки 0,08 М фосфатным буфером, a IgM — 0,3 М буфером при том же pH. Можно вести очистку и в объеме, суспендируя ионообменник в растворе глобулинов (в том же буфере) при объемном соотношении 1 : 5. Суспензию выдерживают с периодическим перемешиванием в течение часа при 4°, после чего обменник промывают на стеклянном фильтре несколькими порциями буфера. При очистке IgG из сыворотки человека лучше использовать 0,01 М фосфатный буфер, а при очистке IgG кролика — 0,0175 М буфер. Для предотвращения последующей агрегации белка буфер подтитровывают с помощью 1 М К2НР04 до pH 7,5.
Следует иметь в виду, что за счет различия состава гипервариабильных областей IgG не вполне гомогенны по заряду и иногда могут элюироваться в довольно широком диапазоне концентраций буфера, порой даже перекрываясь с другими глобулинами. Однако в большинстве случаев ограничиваются описанной выше простейшей процедурой хроматографической очистки.
Очищенная таким образом антисыворотка полиспецифична (поливалентна), хотя может быть и очень сильно обогащена антителами одной определенной антигенной специфичности. Если этого недостаточно, то для дальнейшей очистки моноспецифиче-ских антител используют иммуносорбенты.
Прежде чем описывать используемые при этом приемы, обратим внимание на то, что необходимое условие получения узкоспецифического иммунного ответа — совершенная чистота бел-ка-антигена, используемого для иммунизации. Эта чистота должна отвечать иммунологическим, а не электрофоретическим критериям. Последние для данной цели не адекватны: в одной полосе при электрофорезе могут оказаться несколько различных белков и, наоборот, один чистый антиген может иногда дать несколько полос, если он существует в нескольких иммунологически равноценных конформациях.
Достаточным критерием иммунологической чистоты белка можно считать образование только одной полосы преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии (см. ниже), когда с испытуемым очищенным белком взаимодействует поливалентная антисыворотка, полученная в ответ на введение животному неочищенного белка. Здесь уместно напомнить, что даже идеальная очистка белка-антигена не гарантирует строгой однозначности иммунного ответа. У разных особей данного вида животного введение одного и того же, совершенно чистого антигена может вызвать различные иммунные ответы. В одном случае это может быть гиперпродукция практически гомогенной специфической популяции антител, в другом — ответ может оказаться поливалентным, так что в антисыворотке появится целый набор антител, способных связывать исходный антиген (но не только его). Этот набор иногда можно разделить электрофорезом или ИЭФ. О причинах поливалентного иммунного ответа было подробно сказано выше. Ввиду такой возможности иммунизацию, как уже упоминалось, следует проводить параллельно на нескольких животных, с тем чтобы иметь возможность выбора наиболее «чистой» моноспецифической антисыворотки. После этих необходимых замечаний можно рассмотреть заключительный этап очистки антител— использование иммуносорбентов.
Иммуносорбенты для очистки антител
Иммуносорбентами называют иммобилизованные антитела или антигены, сохранившие способность к образованию иммунных комплексов. Здесь нас будет интересовать вариант иммуно-
сорбента с иммобилизованным антигеном. При пропускании через колонку такого сорбента антисыворотки или частично очищенной фракции IgG он связывает и задерживает только специфические для данного антигена антитела. Все остальное, вообще говоря, можно отмыть буфером. Трудности, как мы увидим дальше, могут возникать из-за явления неспецифической сорбции бел-ков на матрице сорбента, но есть средства для их преодоления. Специфически сорбированные и тем самым хорошо очищенные, антитела нетрудно снять с иммуносорбента путем диссоциации их комплексов с молекулами антигена при существенном изменении pH буфера или увеличении концентрации в нем соли.
Для приготовления антигенных иммуносорбентов используют два способа. В первом из них достаточно концентрированный раствор антигена превращают в пространственную сетку, сшивая молекулы белка между собой глютаровьш альдегидом или другим бифункциональным агентом. Второй способ состоит в ковалентном связывании антигена с гидрофильной водонерастворимой полимерной матрицей типа полиакриламида, агарозы или сефадекса.
