Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Некоторые авторы рекомендуют вводить антиген в смеси с адъювантом (подкожно) одновременно в область затылка (0,4 мл) и в обе задние лапы близ ахиллесова сухожилия {по 0,3 мл). В последние годы часто практикуется рассредоточенная пбдкожна я инъекция — одновременно в 20 местах на спине жи> вотного. При введении раствора кожу следует слегка оттянуть так, чтобы игла под ней свободно перемещалась. Вводят раствор медленно, кожу смазывают иодом, но шерсть не выстригают — она предохраняет место инъекции от охлаждения, что способствует всасыванию антигена. Иногда, в случае необходимости экономии антигена, используют микровариант иммунизации с введением по 10—50 мкл 5%-ного белкового раствора по приведенной выше схеме в подушечки всех четырех лап кролика. Эту операцию производят с помощью шприца Гамильтона. Она очень болезненна и требует анестезии. В любом варианте иммунизация занимает несколько недель.
Так называемый «неполный адъювант Фрейнда» представляет собой смесь трех частей легкого минерального масла, одной части безводного ланолина и четырех частей 0,15 М фосфатного буфера. В состав «полного адъюванта Фрейнда» входят также микобактерии (например, авирулентная или убитая туберкулезная палочка) в конечной концентрации 10 мг/мл. Адъювант следует использовать в виде свежеприготовленной эмульсии. Эмульгирование осуществляют перемешиванием на большой скорости или многократным пропусканием через тонкую иглу шприца. Операцию эту повторяют и при смешивании адъюванта с раствором антигена, который добавляют понемногу, иногда с подогревом до 37°.
’ Использование адъюванта Фрейнда, как правило, весьма заметно увеличивает интенсивность иммунного ответа. Этот эффект приписывают раздражению и стимулированию местного воспаления ткани, что приводит, с одной стороны, к мобилизации и пролиферации макрофагов, а с другой —к образованию отека и замедлению рассасывания и поступления антигена в кровоток. В какой-то степени этим имитируется нормальная скорость раз-
множения инфицирующих агентов при заражении. Во время повторных, усиливающих ответ инъекций антигена адъювант не добавляют (или добавляют неполный адъювант). При любых вариантах иммунизации белок растворяют в стерильном 0,15 М растворе NaCl. Сам белок можно не стерилизовать — внесение небольшого количества микроорганизмов в процессе иммунизации для кролика не опасно.
Приготовление антисыворотки
Перед началом иммунизации отбирают небольшую порцию крови для приготовления нормальной контрольной сыворотки. Кровь отбирают и в ходе иммунизации для наблюдения за ростом содержания иммунных антител. Когда это содержание становится достаточным, из ушной вены берут кровь для приготовления антисыворотки (40—50 мл). В тот же день можно ввести кролику очередную порцию антигена, а через восемь дней — снова брать кровь. Затем следует дать животному отдохнуть в течение четырех недель. После этого достаточно одной инъекции антигена, для того чтобы содержание в крови нужных антител восстановилось на прежнем уровне. Таким образом, удается использовать одного иммунизированного кролика в течение года. Некоторые исследователи предпочитают брать кровь у кролика прямо из сердца, осторожно вводя в него длинную иглу 18-го калибра. В норме кролик после этого остается жив.
О способах контроля за содержанием («титром») антител в сыворотке крови сказано ниже. Сыворотку получают, давая взятой крови свернуться в течение 30 мин и затем удаляя сгусток центрифугированием. Если из сыворотки нужно убрать комплемент, то ее прогревают в течение 30 мин при 56°. Белки комплемента при такой обработке денатурируют, а антитела ее выдерживают.
Обогащенную нужными антителами сыворотку крови (антисыворотку) хранят в лиофилизированном или замороженном (при —20°) виде. Антитела при замораживании и оттаивании не утрачивают своей активности. Однако если они были переведены в фосфатный буфер, то замораживать надо по возможности быстро, так как при замерзании этот буфер проходит фазу сильнокислой эвтектики, поскольку двузамещенный фосфат кристаллизуется раньше, чем однозамещенный. Такое закисление может инактивировать антитела.
Для защиты от микрофлоры в антисыворотку или раствор антител можно добавить до 0,1% азида натрия или до 0,01% мер-тиолата.
Очистка иммуноглобулина типа IgG
Очистку антител начинают с отделения IgG от прочих белков антисыворотки, в том числе и от остальных иммуноглобулинов. В тех случаях, когда нет необходимости в получении моноспеии-
фических антител, этим и ограничиваются. Очищенная фракция IgG содержит в этом случае и все нормальные антитела, находившиеся в сыворотке животного до иммунизации, но значительная часть (~ 10%) молекул IgG представляет собой специфические антитела, выработанные в ответ на введение использованного для иммунизации антигена.
Отделение суммарной фракции IgG начинают с фракциони* рования сывороточных белков сульфатом аммония (СА). Напомним, что глобулины отличаются от альбуминов именно тем, что они нерастворимы в водном растворе СА, концентрация которого составляет 50% от насыщающей. Поэтому очистку начинают с осаждения глобулинов, для чего в антисыворотку добавляют сухой СА до концентрации 50% от насыщения (примерно до 2М), осадок растворяют и операцию осаждения СА повторяют еще раз. Соль из вновь растворенного осадка удаляют диализом или гель-фильтрацией. Нередко для лучшей очистки проводят осаждение меньшей концентрацией СА (33% от насыщения), для чего к данному объему антисыворотки добавляют половинный объем насыщенного раствора СА и эту операцию после растворения осадка в воде повторяют 3—4 раза. Разумеется, за улучшение очистки при этом приходится расплачиваться некоторым уменьшением выхода IgG.
