Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
В настоящее время трудно сказать точно, насколько найденные величины отражают действительное содержание отдельных структур в молекуле транскетолазы. Хорошо известно, что целый ряд факторов, которые еще недостаточно изучены и обычно не учитываются при количественных расчетах тех или иных структур в белке, могут влиять на его оптическую активность. К ним относятся длина и пространственное расположение спиральных участков, наличие дисульфидных связей, Коттон-эффекты остатков ароматических аминокислот, аполяр-мое окружение спирализованных участков (о чем
59
подробнее говорилось выше) н многие другие (421, 430, 470, 490, 502]. Этим в основном и объясняется несоответствие результатов, получаемых разными методами. Так, например, согласно данным рентгеностр) ктурных исследований, в молекуле лизоцима содержится 35% спиральной формы, 10% Р структуры и 55% статистического клубка. В то же время методом Гринфильд и сотр. обнаружено соответственно 26, 26 и 48% [183]. Несоответствие экспериментальных величин, определяемых разными методами, отмечалось при исследовании и других белков, но выражено оно бьпо в меньшей степени.
С учетом всего вышесказанного можно считать, что примерное содержание отдельных структур в молекуле транскетолазы равно: а-спирали— 20%, p-форма— 40, статистический клубок — 40%. В щелочной области происходит разрушение p-формы; полное — при pH выше 11. В кислой области она более стабильна.
РЕНДТУРАЦИЯ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ
Ренатурацию транскетолазы после ее выдерживания при различных значениях pH осуществляли последующим доведением pH до 8 путем добавления соответствующего буфера или диализом против того же буфера [26]. В обоих случаях при ренатурации фермента из кислых растворов наблюдалось образование осадка, если концентрация белка в исходном растворе была относительно высокой. Лишь при концентрации, равной
0,2 мг/мл и ниже, осадок не образовывался. Такая концентрация недостаточна для исследований фермента методом дисперсии оптического вращения, тем более, что в процессе проведения ренатурации она еще снижается вдвое. Поэтому возможность восстановления оптических характеристик фермента после его кислотной денатурации не исследовали и ограничились областью щелочных воздействий. Восстановление же активности, для определения которой требовались лишь незначительные количества фермента, исследовали во всем диапазоне pH от 1,75 до 12,7.
Как следует из данных, приведенных в табл. 4, в щелочных условиях наблюдается резкое уменьшение сте-
60
Таблица 4
Обратимость кочформщионных изменений транскетолазы после щелочной денатурации [26]
Параметры pH 8 pH и pH 12 pH 12,7
денату ренату- денату ренату- денату ренату-
рация рация рация рация рация рация
---130 ---85 ---126 ---15 -120 0 ---120
пь0. % 30 22 29 11 28 8 28
•Ves 66т 285 62") -140 570 ---314 450
^Aies* °° 39 28 38 17 36 12 33
'Vis ---555 -393 ---500 270 ---510 ---165 ---450
1 \ 0 33 ---п 26 11 23 5 20
А226* ^
пени спирализации транскетолазы по сравнению с исходным ее состоянием. При реиатурации общая структура в основном восстанавливается, : отя отдельные характеризующие ее параметры восстанавливаются в неодинаковой степени.
Несколько иная картина наблюдается при измерении каталитической активности ренатурированного фермента (рис. 9). Только после денатурации при. pH 8—9 (в данном случае рассматриваются лишь щелочные условия денатурации) она остается практически неизменной. С переходом в более щелочную область активность снижается, а в результате выдерживания при pH 12 снижается более чем наполовину.
Таким образом, при ренатурации общая конформация транскетолазы восстанавливается значительно легче», чем ее ферментативная активность. Это и не \ швительно, так как «общая конформация» — достаточно грубая характеристика, если идет речь о возможных незначительных изменениях структуры, касающихся локальных участков белковой молекулы. А именно такие изменения, происходящие в тонко организованном \частке активного центра фермента, и могут быть решающими для проявления каталитической активности.
Из приведенных выше экспериментальных данных, однако, еще не следует, что те локальные изменения тонкой структуры транскетолазы, которые сопровождается (или являются причиной) потерей ферментативной
61
Рис. 9. Активность транскето-лазы, предварительно выдержанной при различных значениях pH [26]
О Z 6 Ю pH
активности, вообще необратимы. Считается [1, 76, 151, 195, 334], что формирование нативной структуры белка осуществляется спонтанно и определяется составом н последовательностью аминокислотных остатков поли-пептидной цепи. Это было показано на примере многих ферментов, когда после применения жестких денатурирующих воздействий происходило полное раз\порядо-чивание белковой молекулы, а затем, после снятия этих воздействий, наблюдалось восстановление исходной структуры и каталитической активности. С ннзкомоле-кулярными, одноцепочечными ферментами типа рнбо-нуклеазы активность ренатурированных ферментов не отличалась от их активности до денатурации, причем дису'льфидные связи, если они первоначально имелись и были разорваны при денатурации, образовывались при участии тех же самых цистеиновых остатков, как это было характерно для нативного фермента {77, 544, 545].
