Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 24

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 86 >> Следующая

Итак, в апотранскетолазе обнаруживаются две формы фермента, а в холотранскетолазе — только одна. Здесь могут иметь место две возможности.
1. Холотранскетолаза также представлена двумя изо-форма ми, но они не разделяются теми методами, которые испотьзовали в работе. Возможно, потому, что фосфат не взаимодействует с холотраискетолазой так, как с апоферментом, где проявлялось его специфическое влияние, позволившее идентифицировать изоформы (см. рис. 11).
2. При взаимодействии с тиаминпирофосфатом и образовании холот.ранскетолазы изоформа II переходит в изоформу I, и холофермент, таким образом, представлен только одной формой.
В связи с материалом, изложенным в настоящем разделе, по-видимому, уместно привести резу тьтаты, полу-
68
ченные с препаратами фермента, больше года хранившимися на холоду в виде суспензии кристаллов в сульфате аммония 40—50% насыщения. Каталитическая активность таких препаратов сохраняется, как правило, неизменной, кофермент, естественно, полностью отщепляется. При попытке растворить такие ферментные препараты в воде или буфере лишь часть фермента переходит в раствор. Оставшийся осадок можно многократно промывать водой, и он не растворится. Лишь в присутствии магния и тиаминпирофосфата, взятых в достаточно высоких концентрациях, он начинает растворяться. Оказалось, что в растворимой фракции обнаруживается (если судить по величине транскетолазной активности) около 60% общего количества фермента, а в «нерастворимой» фракции—40%, т. е. соотношение получается примерно такое же, как и для изоформ транскетолазы (см. рис. 11).
Глава пятая ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ
СУЛЬФГИДРИЛЬНЫЕ ГРУППЫ
Многие тиаминовые ферменты ингибируются сульф-гидрильными реагентами и активируются (особенно в высокоочищенном состоянии) такими соединениями, как цистенн, меркаптоэтанол или восстановленный глютати-он [65, 78, 85, 209, 242, 294, 363, 478, 557]. Эти данные указывают на то, что сохранность сульфгидрильных групп необходима для нормального функционирования тиами-новых ферментов; по крайней мере, большинства из них. Применительно к некоторым ферментам этот вопрос был изучен более подробно.
Всего в молекуле апопируватдекарбоксилазы, изолированной из пируватдегидрогеназного комплекса Е. coli, определяется восемь сульфгидрильных групп. При нейтральной реакции среды две из них относительно быстро реагируют с органическими соединениями ртути, такими как гс-меркурибензолсульфонат и м-меркурибензоат. При молярном отношении реагента к энзиму, равном 5:1, взаимодействие заканчивается за 2 мин. Фермент при этом полностью теряет каталитическую активность, которая может быть восстановлена добавлением цисте-ина [456]. Молекула пируватдекарбоксилазы из Е. coli состоит из двух субъединиц и имеет коэффициент седиментации, равный 9,2S. После связывания в ферменте двух сульфгидрильных групп величина коэффициента седиментации не изменяется. Следовательно, инактивация пируватдекарбоксилазы не сопровождается ее распадом на субъединицы.
Пируватдекарбоксилаза в пируватдегидрогеназном комплексе связана с лнпоилтрансацстилазой. Чтобы выяснить, не влияет ли на связывание блокирование сульфгидрильных групп пируватдекарбоксилазы, ставили
70
следующие эксперименты [456]. Пируватдекарбоксилазу обрабатывали /г-меркурибензолсульфонатом, используя его в такой концентрации, чтобы фермент был заинги-бнрован примерно на 80%- Обработанный таким образом фермент смешивали с липоилтрансацетилазой. Часть смеси исследовали в ультрацентрифуге на наличие комплекса пируватдекарбоксилаза —липоилтрансацетилаза, а другую часть использовали для определения ферментативной активности как в полной системе (с использованием лнпоилдегидрогеиазы и НАД), так и в искусственной системе с феррицианидом в качестве акцептора электронов. Оказалось, что образование комплекса пируватдекарбоксилаза—липоилтрансацетилаза происходит совершенно одинаково как с нативным ферментом, так и с ферментом, обработанным сульфгидрильным реагентом. Величина остаточной активности пируватдекарбоксилазы после ее комплексирования с липоилтрансацетилазой также не изменялась. Количество титруемых сульфгнд-рильных групп и их реакционноспособность в свободной пируватдекарбоксилазе и в составе комплекса были идентичны. Приведенные данные указывают на то, что активный центр пируватдекарбоксилазы и ее участок связывания с липоилтрансацетилазой независимы.
Степень инактивации пируватдекарбоксилазы под действием сульфгидрильного реагента существенно снижалась при совместном добавлении тиаминпирофосфата и магния. Магний сам по себе, а также пировиноградиая кислота никакого влияния не оказывали [456]. Заметим, что в то время как в апоферменте быстро титруемых SH-групп было две, в холоэнзиме их определялось четыре [456]. Более того, связывание в последнем случае двух групп никак не сказывалось на величине ферментативной активности. Только когда были блокированы и две другие группы, активность снижалась до нуля. Эти две сульфгидрильные группы, существенные для активности, очевидно, те -самые, которые титруются в апоферменте.
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed