Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 17

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 86 >> Следующая

Известно, что транскетолаза при pH 7,6 достаточно стабильна [193], но инактивируется при сильном разведении ферментного раствора [126]. Как и при инактивации (pH выше 11), о чем говорилось выше, снижение каталитической активности фермента при разведении также можно объяснить его распадом на субъединицы, которые, по-видимому, более лабильны, чем димерная форма транскетолазы.
Молекула транскетолазы, выделенной из пивных дрожжей, также имеет димерное строение. Мол. вес ее, определенный методом гель-фильтрации, равен 100000+6000 [504].
Мол. вес пнруватдекарбоксплазы, выделенной из пивных дрожжей, составляет величину 175 000 [512, 516]. По другим данным —185 000 [384].
48
В присутствии мочевины (уже при малой ее концентрации) наблюдается быстрая и необратимая инакти-пация фермента, однако распада на субъединицы не происходит [516]. Только выдерживание в 6М растворе гуанидинхлорида в течение нескольких дней сопровождается появлением компонента с мол. весом 90 000 [512]. Добавление меркаптоэтанола не сказывается на конечном результате, из чего можно заключить, что в образовании функциональной формы фермента дисульфидные связи участия не принимают.
При низких значениях pH пируватдекарбоксилаза пекарских дрожжей находится исключительно в димерной форме с мол. весом около 200000 [177]. При смещении pH от 7 в щелочную область наблюдается распад на субъединицы одинакового молекулярного веса. В фосфатном буфере равновесие смещено в сторону димерной формы, а грыс-буфер благоприятствует образованию мономеров. Активна димерная форма фермента. Мономеры каталитическими свойствами, по-видимому, не обладают. Процесс диссоциации на субъединицы обратим, и при подкислении раствора димерная форма восстанавливается. Одновременно происходит восстановление исходной ферментативной активности. Субъединицы менее стабильны, чем нативная пируватдекарбоксилаза, и при стоянии способность к реассоциацнн постепенно пропадает.
Пируватдекарбоксилаза, изолированная из пируват-дегидрогеназного комплекса Е. coli, на седиментограмме при ультрацентрифугировании (pH 7,5) представлена твумя пиками: один из них соответствует мол. весу около 175 000, а другой — примерно 90000 [142]. Вся ферментативная активность сосредоточена в первом инке. При выдерживании в течение нескольких часов при pH 9,5 количество легкого компонента увеличивается, а количество тяжелого уменьшается, что сопровождается снижением ферментативной активности. Полностью перевести фермент в мономерную форму удалось обработкой 10 М мочевиной в присутствии меркаптоэтанола [142], 1%-ным додецилсульфатом натрия в присутствии меркаптоэтанола или 6М гуанидинхло-ридом, также при наличии в среде меркаптоэтанола [531]. Для молекулярного веса пируватдекарбоксилазы из К, coli, кроме величины 175000, которая приведена выше,
49
были получены также значения 183 000 [154], 190 000 [142, 150] и 200 000-220 000 [531].
Судя по данным ультрацентрифугирования, электрофореза и гель-фильтрации, субъединицы пируватдекар-боксилазы Е. coli, по видимому, идентичны. В пользу этого свидетельствует и то, что N-концевой аминокислотой является только серии в количестве двух остатков на молекулу фермента [142, 531]. Обе формы пируват-декарбоксилазы (мономерная и димерная) способны связываться с липонлтрансацетилазой, однако ферментативная активность пируватдегидрогеназного комплекса проявляется лишь в том случае, если в его рекомбинации участвует димерная форма, а не мономер [142].
Кристаллические препараты пируватдекарбоксилазы, изолированные из пируватдегидрогеназных комплексов почек и сердца быка, оказались очень близкими по своим физико-химическим свойствам [84]. При диск-электрофорезе в полиакриламидном геле без детергента они мигрируют одной белковой полосой. В присутствии додецилсульфата натрия обнаруживаются две фракции, одна из которых имеет мол. вес 42 000, а другая — 37 000. Нативная пируватдекарбоксилаза имеет мол. вес 154 000, определенный методом седнментационного равновесия. Отсюда авторы сделали вывод, что фермент состоит из двух типов субъединиц и имеет структуру а2р2.
С} 5ъединицы были разделены хроматографически на фосфоцеллюлозе в присутствии 8М мочевины и исследованы. Оказалось, что они различаются по аминокислотному составу и особенно резко различны пептидные карты их триптических гидролизатов.
Предполагается [84, 419], что обе субъединицы (а и р) выполняют каталитическую функцию, причем а-субъединица (мол. вес 42 000) осуществляет первый этап реакции окислительного декарбоксилирования пнру-вата, т. е. отщепление С02, а р-субъециннца (мол. вес 37 000)—последующее восстановительное апеллирование остатка липоевой кислоты. Прямых доказательств этому пока не получено, но аргументы, приводимые авторами в пользу такой возможности, выглядят достаточно убедительно. Аргументы эти следующие.
Как уже говорилось, пируватдекарбоксилаза осуществляет два первых этана окислительного декарбокенлн-
50
ровання пирувата — отщепление СО., и последующее восстановительное аиетилнрование остатка ляноевой кислоты липонлтрансацетнлазы. Фосфорилнровапие пируватдекарбоксилазы полностью ингибирует ее каталитическую активность, причем фосфорнлируется только а-субъеднница [84] (подробнее на этом мы остановимся позднее). Оказалось, что при этом нарушается только первый этап реакции — отщепление С02 от пирувата, в то время как второй этап — перенос активированного альдегида на лнпоевую кислоту — протекает гак же, как и с нативным ферментом. Последнее было продемонстрировано путем использования в энзиматической системе вместо пирувата и тнампиппрофосфата оксиэтнльного производного кофермента — первого промежуточного продукта декарбокенлирования пирувата. Восстановительное ацетилированне остатка лнпосвой кислоты в данном случае протекало с одинаковой скоростью как с фосфорнлнрованным, так и с нефосфо-рилированным ферментом.
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed