Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
В тех же условиях индивиду альная активность декар-боксилазного компонента пируватдегидрогеназного комплекса, измеренная в искусственной системе с использованием в качестве переносчика электронов фер-рицнаннда, резко снижается уже в самом начале инкубации с ингибитором: через 1 мин остается лишь 25— 30% первоначальной активности. Затем скорость инактивации замедляется (рис. 2). В противоположность пиру-ватдегидрогеназному комплексу ингибирование пируват-декарбоксилазы не усиливается при добавлении тиамин-пирофосфатг и на первом этапе идет с одинаковой скоростью как в его присутствии, так и без него. А па втором, более медленном этапе тиамиипирофосфат даже несколько предохраняет фермент от ингибирования (сравни кривые 3 и 4 на рис. 2).
42
Одновременное определение индивидуальном активности других компонентов комплекса показало, что активность липонлтрансацетплазы не изменяется, а активность липоилдегидрогеназы хотя и снижается, но, во-первых, незначительно, а во-вторых, в одинаковой степени и с одинаковой скоростью независимо от того, добавляли или не добавляли в систему тнаминпиро-фосфат.
Повышением концентрации ингибитора в присутствии тиаминпирофосфата примерно в 30 раз по сравнению с тон, которую использовали в вышеописанных опытах, удалось добиться полной инактивации пируватдегидро-геиазного комплекса. Активность индивидуальных ферментов комплекса при этом оставалась все еще высокой [338].
Таким образом, бромпируват неодинаково действует на целый комплекс и на составляющие его компоненты. Различия заключаются в том, что наблюдается разная степень ингибирования: полная — для пируватдегидро-гсназного комплекса и частичная — для индивидуальных ферментов; в первом случае процесс стимулируется тиаминпирофосфатом, а во втором — от него независим.
Параллельно с измерением активности исследовали включение метки в пируватдегидрогеназный комплекс, для чего использовали бромпируват, меченный по второму углеродному атому. Полная потеря ферментативной активности сопровождалась включением 50— 60 г-атом ‘*С на моль комплекса. В отсутствие тнамин-пирофосфата, когда ингибирование было лишь частичным, содержание метки в белке было в четыре раза меньше. Вся ли молекула бромпнрувата связывается с комплексом или какая-то ее часть (например, остаток альдегида после возможного отщепления С02)—остается неизвестным. Неизвестно также, с каким компонентом комплекса взаимодействует ингибитор. Ясно лишь, что связывание ингибитора необратимо, так как метка обнаруживалась в ферментном препарате после его пропускания через сефадекс.
Итак, существенное снижение общей активности пируватдегидрогеназного комплекса происходит только при наличии в системе тиаминпирофосфата. При соответствующих условиях комплекс может быть полностью заингибирован, в то время как активность пируват-
43
декарбоксилазы остается еще Достаточно высокой. Более того, ингибирование пируватдекарбоксилазы практически не зависит от тиаминпирофосфата. Все эти данные указывают на то, что бромпируват взаимодействует с пируватдекарбоксилазным компонентом ппруват-дегидрогеназного комплекса (не блокируя его активный центр) и претерпевает начальные этапы ферментативного превращения, характерного для окислительного декарбокенлирования пировиноградной кислоты. На последующих этапах процесс обрывается. Промежуточный продукт превращения бромпирувата остается необратимо связанным с пнруватдегидрогеназиым комплексом, что и приводит к потере общей ферментативной активности. По-видимому, это происходит на стадии восстановительного ацетилирования остатка липоевой кислоты, ковалентно связанной с лппоплтрансацетилазой. Индивидуальная активность данного фермента (в искусственной системе) при этом не изменяется [338], так как в ее проявлении остаток лнпсевой кислоты не участвует [296].
Об инактивации пнруватдекарбоксилазного компонента пируватдегидрогеназного комплекса, независимой от тиаминпирофосфата, никаких других данных, кроме приведенных выше, в литературе не найдено. Поэтому сказать что-либо определенное об этом процессе в настоящее время не представляется возможным.
Эксперименты с использованием бромпирувата следует считать перспективными. Они могут дать много полезной информации об общем механизме окислительного декарбокенлирования и отдельных стадиях этого процесса, так как указанный ингибитор является аналогом субстрата, действует специфически, связывается необратимо и, очевидно, претерпевает начальные этапы обычного для субстрата ферментативного превращения.
Другие ингибиторы. В присутствии 1-10-3 М цинка активность оксоглутаратдекарбоксилазы из Mycobacterium phlei не проявляется [557]. Так же действует и медь на пируватоксидазу из Proteus vulgaris [493]. Оба эти катиона полностью ингибируют транскетолазу из пивных дрожжей [377], причем действие ионов меди практически необратимо, в то время как фермент, заингибнрованный цннком, восстанавливает активность после его пропускания через сефадскс. В меньшей сте-
44
пени ингибирующее действие вышеуказанных металлов выражено у транскетолазы, изолированной из печени свиньи. При концентрации 2-10-3 Л\ медь и цпик снижают величину ферментативной активности соответственно на 50 и 8% [476]. Фосфат и сульфат в концентрации 1 -10-2—2-10_2М снижают ферментативную активность кристаллических препаратов транскетолазы пекарских дрожжей на 50% [134]. Примерно такой же эффект получен и с пируватдекарбоксилазой, выделенной из пивных дрожжей [180], и с транскетолазой нз зародышей выона [33]. С другой стороны, активность пнруватдекарбоксплазы из мозга быка максимальна только в фосфатном буфере. Со всеми другими буферами она была значительно снижена, а в трис-IIC1 буфере — вообще отсутствовала [48]. Ингибирующее влияние трис-ПС1 буфера отмечалось и в опытах с глиокенлаткарбо-лнгазой [82].
