Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 26

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 86 >> Следующая

В ацетолактатсинтетазе Aerobaeter aerogenes при pH 8 определяются три сульфгидрильные группы [506]. Ре-акционноспособность их примерно одинакова. Блокирование SH-групп сопровождается снижением ферментативной активности. При связывании одной группы достигается 60% ингибирования. Пируват никакого влияния не оказывает, а в присутствии фенилпирувата (конкурентного аналога субстрата) количество определяемых SH-групп равно двум. Авторы полагают, что одна сульфгид-рильная группа (предохраняемая от блокирования фе-нилпируватом) расположена в непосредственной близости от субстрат-связывающего участка. Всего же в молекуле ацетолактатсинтетазы четыре сульфгидрильные группы, причем четвертая группа становится доступной для титрования не только в додецилсульфате натрия, но и при добавлении ацетата, который является активатором фермента: в его присутствии активность фермента при >рН 5,8 увеличивается вдвое [487].
ИМИДАЗОЛЬНЫЕ ГРУППЫ ОСТАТКОВ ГИСТИДИНА
Изменение активности транскетолазы пекарских дрожжей в процессе ее фотооблучения
В качестве сенсибилизатора использовали метиленовый синий. Источником излучения служила лампа накаливания мощностью 200 вт. Исследования проводили при
74
Рис. 14. Фотоинактивация транскетолазы [22]
1 — контрольные пробы (на свету без метиленового синего и с метиленовым синим, но в темноте); 2—фотооблучсние в присутствии метиленового синего; о — то же, что н а (кривая 2), но в полулогарифмических координатах
комнатной температуре в атмосфере воздуха. В этих условиях фермент быстро инактивировался — через 15 мин облучения оставалось менее 50% исходной активности (рис. 14, а, кривая 2). Инактивация была обусловлена исключительно воздействием фотооблучения в присутствии сенсибилизатора, так как сами по себе ни метиленовый синий, ни выдерживание на свету никакого влияния на транскетолазу не оказывали — активность в контроле в процессе проведения эксперимента сохранялась на исходном уровне (см. рис. 14, а, кривая 1).
Заметим, что при исследованиях методом фотоокисления, как правило, используют более жесткие условия по сравнению с приведенным случаем, т. е. опыты проводятся при интенсивной аэрации фотооблучаемых проб с применением мощного источника излучения, а в некоторых случаях и при достаточно высокой температуре — до 40° [3, 140, 539, 540, 543]. Согласно литературным данным, из всех способных фотоокисляться аминокислот наиболее восприимчив при pH 7,6 (условия проведения описываемых экспериментов) — гистидин. Это было неоднократно показано и в модельных системах со свободными аминокислотами [87, 539, 540, 543], и при исследовании различных ферментов [159,342, 362, 543].
75
При графическом изображении экспериментальных данных по фотоииактиваиии транскетолазы, приведенных на рис. 14, а (кривая 2) в полулогарифмических координатах, получается прямая линия (см. рис. 14, б). Этот график описывается уравнением первого порядка.
где Ло — исходная активность транскетолазы, А,— активность через интервал времени t, Кл — константа скорости инактивации. Таким образом, фотоинактивация транскетолазы, так же как и фотоокисление свободных аминокислот,— реакция первого порядка. Другими словами, фотоинактивация транскетолазы — результат разрушения одного аминокислотного остатка (или нескольких, но однотипных), сохранение которого необходимо для проявления каталитической активности данного фермента. Промежуточные формы фермента, с частично сохранившимися каталитическими свойствами, при этом не образуются [342, 404, 405, 543].
Изменение спектра транскетолазы в результате ее фотооблучения
Спектрофотометрнческие исследования фотоокислен-ных ферментов с целью идентификации функциональных групп, разрушающихся в процессе фотооблучения, оказываются наиболее эффективными в тех случаях, когда фотоокисляются только остатки гистидина, в то время как остатки других аминокислот не разрушаются. Так как именно такой вариант предполагался для транскетолазы, то и были проведены соответствующие исследования.
Па рис. 15 изображен дифференциальный спектр фо-тооблученной транскетолазы (степень фотоинактивации фермента в данном случае составляла 50%). Такой тип дифференциального спектра обычно получается при фо-тоокислении гистидина, причем и в модельных системах [159, 530, 542], и в том случае, когда он входит в состав молекулы белка [159, 160, 417, 542]. Был даже предложен количественный метод определения гистидина, разрушающегося в процессе фотоокисления, который дал
7G
4v7/%
Рис. 15. Дифференциальный спектр фотооблученной траискетолазы [22]
Степень фотоииактивпцни — 50%
Рис. 16. Влияние pH на степень фотоинактнвации траискетолазы [22]
хорошие результаты при исследовании глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы [159, 160] и фосфоглюконатдегид-рогеназы [417].
Зависимость скорости фотоинактивации траискетолазы от pH среды
Как уже указывалось, скорость фотоинактивацни траискетолазы при pH 7,6 и в мягких условиях проведения эксперимента относительно высокая. Па том же уровне она остается ,и при смещении pH на половину единицы как в ту, так и в другую сторону. При переходе в область низких значений pH скорость фотоинактнвации существенно снижается (рис. 16). Аналогичный тип кривой (в области pH 8 и ниже) обычно получают при исследовании зависимости скорости фотоокисления свободного гистидина от pH в модельных системах [87, 479, 480, 539, 543]. Зависимость эта характерна и может служить достаточно надежным критерием для идентификации важных в функциональном отношении остатков гистидина, входящих е состав молекулы фермента. Такое
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed