Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Следует, однако, заметить, что для восстановления всех связей, разорванных в процессе денатурации, и нативных свойств фермента требовался подбор соответствующих условий и сам процесс ренатурацип зачастую осуществлялся довольно медленно. Например, в случае панкреатической рибонуклеазы необходимо было даже добавить специальный «сшивающий» фермент, чтобы повысить скорость и степень ее реактивации [141, 162, 168, 175].
Нельзя поэтому исключить, что в определенных условиях можно полностью восстановить и активность траискетолазы, денатурированной при экстремальных значениях pH.
В молекуле белка, структура которого в значительной степени (но не полностью) разрушена денатурирую-
I
5!
I,
II !§
62
пиши воздействиями, предполагается наличие определенных участков, выполняющих роль своего рода «структурного ядра», которое способствует последующей ренатурации и восстановлению «правильной» нативной конформации или каким-то образом определяет их. Такое «ядро» может быть или гидрофобным — в случае белков с очень низкой степенью спирализацни [47], или спирализованным [221] (при этом не исключается и возможная другая его природа).
Можно думать, что такое спирализованное «ядро» имеется и в молекуле транскетолазы, свидетельством чему является еще достаточно высокое содержание спиральных структур при pH 3 и 12, которое лишь в слабой степени изменяется при дальнейшем смещении pH соответственно в кислую и щелочную область. В то же время, когда pH смещали от 4 до 3 и от 11 до 12, степень спирализацни менялась существенно (см. табл. 3, третья колонка).
ИЗОФОРМЫ
Идентификация изоформ транскетолазы пекарских дрожжей и их препаративное получение
При электрофорезе высокоочищснпых препаратов транскетолазы в полиакриламидном геле в системах ЭДТА — трис—борная кислота (pH разделения 8,9; рис. 10, /) и пиридин — КОН — уксусная кислота (pH разделения 6; рис. 10, 3) было получено четкое разделение на две белковые фракции [277]. Во второй системе, наряду с двумя основными белковыми фракциями, как правило, обнаруживалась еще одна слабо заметная белковая полоса, которая является инактивированной формой транскетолазы, образующейся в процессе проведения эксперимента (мы к этому еще вернемся при дальнейшем изложении материала). Ее не было при электрофорезе свежевыделенных высокоочнщенных препаратов транскетолазы в ЭДТА грис-боратной системе, но она появлялась, если для анализа использовали хранившийся препарат фермента, частично потерявший свою каталитическую активность.
63
Рис. l6. Электрофоретическое разделение фанскетолазы в полиакриламидном геле [277]
Системы разделения: I, 2—ЭДТА — трис-борная
кислота, pH 8,9; 3 — пиридин — КОН — уксусная
кислота, pH 6,0; прокрашено на белок (/, 3) и на .IKTHBliO гь (2)
В
И
7L
+
+ 12-3
Рис. 11. Хроматографирование транскетолазы на КМ-сефадексе (а) и рехрома гография индивидуальных изоформ (бив) [277]
Колонка уравновешена 5-10~2 М калит-фосфатным буфером, pH 5,7 / — белок; 2— ферментативная активность; 3 — кон центра ци1: элюирующего
раствор»!
Обе белковые фракции, разделяемые при электрофорезе, характеризовались транскетолазной активностью, выявляемой гистохимически в соответствующей системе по реакции с нитроголубым тетразолием (см. рис. 10, 2).
Первые попытки разделить изоформы транскетолазы,
64
применив для этой цели метод ионообменной хроматографии, окончились неудачен. Были использованы различные ионообменники, работу проводили в достаточно широком диапазоне pH (от 6,5 до 9,5), тем «е менее во всех случаях фермент элюировался с колонки одним, хотя и не всегда симметричным пиком.
Аналогичные результаты были получены и при работе в условиях более низких значений pH, когда колонка была уравновешена 5-10-2 М калий фосфатным буфером (pH 5,7) и для элюцни использовали раствор хлористого калия в том же буфере. Если, не меняя pH, колонку уравновесить ацетатным буфером и ацетатным же буфером проводить последующую элюцию фермента, то уже намечается частичное разделение изоформ транскетолазы. Практически полно разделить их удалось только при использовании в качестве элюирующего раствора калнй-фосфатного буфера. Снимались они с колонки при концентрации буфера, равной соответственно 1-10"1 М и 2-10-1 М (рис. 11,а).
Во всех случаях, когда работа проводилась при pH 5,7, обнаруживалась белковая фракция, лишенная транс-кетолазной активности (рис. И, а). Появлялась она и при повторной хроматографии индивидуальных изоформ (рис. 11, б, в). Эта фракция — результат инактивации транскетолазы в процессе подготовки и проведения эксперимента (фермент не стабилен прн pH 5,7). Ее содержалось тем больше, чем меньше общей транскетолазной активности, по отношению к исходной, обнаруживалось в элюате.
Чтобы снизить количество неактивной фракции, снимаемой с колонки, элюцию осуществляли градиентом pH исходного калий фосфатного буфера, которым была уравновешена колонка. Ожидаемого эффекта, однако, не получилось. Хотя фермент и снимался в более благоприятных условиях для его стабильности (рН>5,7), тем не менее количество неактивной фракции практически не уменьшалось. Кроме того, происходило значительное размывание пика одной из изоформ.
