Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 23

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 86 >> Следующая

В процессе повторной хроматографии при pH 5,7 каждой из индивидуальных изоформ в отдельности другая изоформа не обнаруживалась (см. рис. И, б, в). Следовательно, при pH 5,7 одна изоформа не может переходить в другую; во всяком случае — с заметной скоро-
3 Г. А Кочетов
65
стью. Однако этого нельзя было исключить TipH более высоких значениях pH, где фермент при хроматографировании его на ионообменных колонках всегда элюировался одним пиком и мог быть представлен только одной изоформой.
Для проверки такой возможности были поставлены соответствующие эксперименты. В первой серии опытов фермент выдерживали некоторое время при pH 9, после чего хроматографировали при pH 5,7, как указано на рис. 11. Получали обычное разделение на две активные фракции, характерные для данных условий хроматографирования. Во второй серии опытов изоформы сначала изолировали путем хроматографирования на КМ-сефа-дексе при pH 5,7. Затем каждую из них хроматографировали при pH 9,0 на ДЭАЭ-сефадексе, получая при этом по одной активной белковой фракции. И, наконец, каждую из них, опять же раздельно, хроматографировали еще раз на КМ-сефадексе при pH 5,7.
Профиль элюции был тот же, что и при обычном повторном хроматографировании индивидуальных нзоформ фермента, без предварительного их пропускания при pH 9 через колонку, заполненную ДЭАЭ-сефадексом.
Таким образом, и при pH 9 переход одной изоформы в другую не происходит. Обе они присутствуют, в растворе, но не разделяются, несмотря на использование различных ионообменников и разных условий разделения. Достичь этого удается только при низких значениях pH и только при использовании калпй-фосфатного буфера па всех стадиях проведения эксперимента [277]. Фосфат, как мы увидим дальше, способен взаимодействовать с транскетотазой. Физико-химические свойства нзоформ при этом изменяются, по-виднмому, неодинаково, что и дает возможность их разделить па ионообменном сефа-дексе. Изменения эти обратимы, и после удаления фосфата изоформы возвращаются к своему первоначальному состоянию. Такой вывод следует из опытов, в которых препарат фермента сначала выдерживали при pH 5,7 в I М калий-фосфатном буфере, затем удаляли фосфат пропусканием через ссфадекс G 50 и проводили обычное хроматографирование при pH 5,7, используя в качестве элюирующего раствора хлористый калий вместо фосфатного буфера. Изоформы при этом не разделялись, и вся активность обнаруживалась в одном пике.
П6
Изоформы транскетолазы были выделены с помощью препаративных колонок и получены в кристаллическом виде. Условия их разделения использовались те же, что указаны на рис. 11.
Некоторые свойства изоформ транскетолазы
Изоформы были гомогенны, согласно данным ультра-нентрифугирования (при pH 6,4 в 2-10-2 М калий-фос-фатном буфере), имели одинаковую величину коэффициента седиментации, равную той, которая была получена тля исходного препарата фермента до его разделения на изоформы. Не обнаружено существенных различий и в обшей структуре при исследовании методом тисперсии оптического вращения.
Изоэлектрическне точки, найденные методом изоэлек-тпического фокусирования, оказались очень близкими (пис 12): для изоформы I—6.43. а для изоформы IT— 6.50. Именно по этой причине изоформы так трудно было разделить методом ионообменной хроматографии.
Рис. 12. IТзоэлектрическое фокусирование транскстолазы [2]
/ — транскетолазная активность: 2 — значения pH во фракциях элюата
1
Изоформы достаточно стабильны при pH около 7,6 н частично инактивируются при смещении pH как в кислую область, о чем уже говорилось выше, так и в щелочную (pH 9 и оыше). В первом случае более ‘неустойчива пзоформа II, а во втором случае — изоформа I. В присутствии фосфата снижение ферментативной активности замедлялось. Особенно наглядно это проявлялось в случае изоформы II.
67
3*
В препаратах транскетолазы, частично разобщенных от кофакторов, изоформа II всегда была представлена только апоферментом, а изоформа I— смесью апо- и хо-лофермента [70]. Другими словами, вся холотранскето-лаза, первоначально присутствовавшая в исходном ферментном препарате, затем обнаруживалась только во фракции, соответствовавшей изоформе I. Создается впечатление, что прочность связи тиаминпирофосфата с изоформами неодинакова. С изоформой II она менее прочная, и кофермент легко отщепляется в процессе выделения и хранения ферментных препаратов.
Более того, если при использовании различных препаратов апофермента соотношение в нем изоформ определялось всегда примерно одинаковым (таким, как на рис. 11, а), то в частично разобщенных препаратах транскетолазы оно существенно зависело от относительного содержания в них апофермента. Чем оно было выше, тем больше обнаруживалось изоформы II и, соответственно, меньше изоформы I (холофермент вообще показывал наличие только изоформы I). Такая закономерность на-бпюдалась до тех пор, пока соотношение нзоформ не становилось равным тому, которое характерно для апофермента (содержание холофермента в препарате бы то при этом еще достаточно высоким). После этого оно не изменялось, несмотря на то, что относительное содержание апотранскетолазы в ферментном препарате продолжали повышать за счет уменьшения хо отранскетолазы [70].
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed