Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
R(tm) NOH
Верхний предел величины пептидов остается неопределенным, так как
некоторые продукты расщепления белков, тради-
202 Глава 4
ционно называемые пептидами, могут быть больше самых маленьких природных
белков. В практической работе можно ориентироваться на верхний предел,
равный 100 аминокислотным остаткам. Более крупные молекулы требуют
методологического подхода, обычно используемого для белков (разд. 4.3).
В ряде случаев пептиды представляют собой биологически очень важные
соединения. Их происхождение может быть весьма разнообразным.
Большая часть исследованных пептидов относится к группе природных. Эти
пептиды очень часто обладают биологической активностью и могут
участвовать в самых различных биохимических реакциях и выполнять другие
функции. Они обычно участвуют в регуляторных процессах, выполняя функции
гормонов или кофакторов ферментов. Большое число пептидов образуется в
качестве продуктов распада в процессе биологического метаболизма белков.
Выделение пептидов из биологических проб сопряжено со значительными
трудностями, обусловленными тем, что пептиды, как правило, входят в
состав сложных смесей с другими пептидами, белками, аминокислотами и
многочисленными соединениями непептидной природы, в которых целевой
пептид содержится в очень малых количествах.
Вероятно, поэтому большая часть изученных пептидов представляет собой
продукты, образующиеся в процессе установления структуры и изучения
крупных белков. Обычно белковую цепь необходимо разделить химическими или
ферментативными методами на небольшие фрагменты, удобные для дальнейшего
структурного анализа. Число методов избирательного и количественного
расщепления, которые дают несколько строго определенных фрагментов,
ограничено. Чаще всего приходится работать со сложной смесью пептидов, из
которой очень трудно выделить целевой пептид в достаточно чистом виде и в
необходимом для установления аминокислотной последовательности
количестве. Задача установления структуры еще более усложняется в тех
случаях, если в пробе содержатся лишь небольшие количества белков,
представляющих интерес для исследователя.
Другой тип пептидов, представляющих интерес для биохимиков, - это
синтетические аналоги и производные природных пептидов. Их удобно
использовать для изучения зависимости структуры и функций, они могут
также представлять определенный фармацевтический интерес. В пептидном
синтезе целевой продукт, как правило, загрязнен пептидами с весьма
близкой аминокислотной последовательностью или конформацией,
образующимися в результате неполного протекания реакций и рацемизации.
Контроль чистоты всех промежуточных форм пептидов, образующихся в
процессе синтеза, и очистка конеч-
Аминокислоты, пептиды, белки 203
ного продукта требуют очень точных аналитических методов.
Хотя происхождение пептидов может быть различным, проблемы,
возникающие в процессе их выделения и очистки, чаще всего очень близки.
Пептиды содержат как гидрофильные, так и гидрофобные остатки аминокислот.
В общем случае их можно считать полярными водорастворимыми соединениями.
Традиционное разделение пептидов выполняется при помощи большого числа
хорошо отработанных методов, таких, как осаждение, гель-проникающая
хроматография, распределение в противотоке, адсорбционная и аффинная
хроматография, хроматография и электрофорез на бумаге и в тонком слое.
Хотя эти хорошо себя зарекомендовавшие методы до сих пор часто и успешно
используются, каждый из них имеет недостатки или" ограничения, например
низкую разрешающую способность, низкий выход продукта или большое время
разделения.
В последние годы ВЭЖХ становится все более важным методом очистки и
даже идентификации пептидов. Очевидно, что ВЭЖХ постепенно вытесняет
многие классические методы, особенно на последних стадиях очистки,
поскольку ВЭЖХ превосходит старые методы по эффективности разделения,
выходу продукта, быстроте анализа и характеризуется низким пределом
обнаружения. Иногда разрабатываются ВЭЖХ-варн-анты классических
хроматографических методов. Однако часто выясняется, что ВЭЖХ действует
как комбинация двух и более классических методов очистки. Это объясняется
тем, что порядок разделения методом ВЭЖХ определяется одновременно
несколькими различными свойствами пептидов, например п зарядом, п
полярностью. Непревзойденная степень разделения, которая достигается при
помощи ВЭЖХ, делает этот метод пригодным для контроля чистоты [70, 71],
составления пептидных карт [72-87] или поисков генетических дефектов [83-
86, 88, 89] в белках. В последнем случае хроматограмму трипсинового
гидролизата аномального белка сравнивают с такой же хроматограммой
соответствующего нормального белка и таким образом обнаруживают один пли
несколько отличающихся пептидов, т. е. проводят современный вариант
анализа по методу "отпечатков пальцев". Пример ВЭЖХ-аналпза генетически
аномальных белков приведен на рис. 4.18. В данном случае сравниваются
