Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
альдегидом. Предел обнаружения составлял 10 пмоль. Хроматограмма,
полученная этим способом, представлена на рис. 4.8.
184 Глава 4
4.1.3. Модифицированные аминокислоты
Разделение модифицированных аминокислот играет важнук> роль во многих
методах исследования химии белка. Как уже говорилось ранее, модификация
аминокислот проводится с целью улучшения их хроматографических
характеристик и характеристик, влияющих на их обнаружение, например
коэффициент поглощения и длины волны, соответствующей максимуму
поглощения. Кроме того, модификация используется для маркировки
аминокислотных остатков пептидов и белков, особенно N-концевого
аминокислотного остатка, т. е. остатка, имеющего свободную а-амнногруппу.
Меченый остаток можно в зависимости от природы метки отщепить путем
гидролиза в присутствии сильной кислоты или в результате
внутримолекулярной перегруппировки, индуцированной меткой. Производные
аминокислот, отщепляющиеся от пептидных цепей, могут быть точно такими
же, как и образующиеся при модификации свободных аминокислот.
В процессе любой реакции модификации аминокислот л первую очередь
образуют производные по а- и е-аминогруппе, если таковая имеется. В ряде
случаев модифицируются и другие реакционноспособные группы, содержащиеся
в боковой цепи, например имидазольная, фенольная, гидроксильная,
сульфгидрильная. Кроме того, на последней стадии реакции модификации
подвергаются а-карбоксильные группы аминокислот.
Наиболее широкое распространение в качестве реагентов для модификации
получили арилфториды или хлориды (реагенты типа реагентов Сэнгера),
альдегиды и изотиоцианаты (реагенты типа реагентов Эдмана). Все они
пригодны для модификации свободных аминокислот, а также для введения
метки при определении N-концевой аминокислоты (за исключением
альдегидов). Только изотиоцианаты образуют производные с пептидами и
белками, модифицированную аминокислоту из которых можно избирательно
отщепить без разрушения остающейся пептидной цепи. Таким образом, прямой
анализ аминокислотной последовательности производится исключительно с
реагентами этого типа.
4.1.3.1. Динитрофениламинокислоты (ДНФ-аминокислоты).
Одним из первых реагентов, примененных для введения метки в а-аминогруппы
аминокислот и пептидов, был фтординитро-бензол [17]. Реакционноспособные
аминогруппы боковых цепей под действием этого реактива также
модифицируются, и для отщепления модифицированных аминокислот от
пептидной цепи требуется кислотный гидролиз. Окрашенные в желтый цвет
ДНФ-аминокислоты можно идентифицировать методом бумажной хроматографии,
тонкослойной хроматографии и
Аминокислоты, пептиды, белки 185
ВЭЖХ. Анализ их методом ВЭЖХ с использованием градиентного элюирования
описан в работе [18].
// ^ NaHC03
o2n Vf + H2N-CHR1-CO-NH-CHR2-CO-....................¦
no2
Фтординитробензол
Q2N-^ ^-NH-CHRt-С O-NH-CHR2-CO------------------^
no2
o2n -^^-NH-CHRj-COOH + NH2-CHR2-COOH +
no2
ДНФ-производное аминокислоты
4.1.3.2. Диметиламинонафталинсульфониламинокислоты (дан-
силаминокислоты). В результате взаимодействия первичных и вторичных
аминогрупп аминокислот с дансилхлори-дом - реагентом типа реагента
Сэнгера - образуются дан-сильные производные аминокислот, которые
характеризуются сильной флуоресценцией. Однако дансилхлорид
взаимодействует не только с а-амино- и иминогруппами аминокислот, но
также и с некоторыми реакционноспособными группами боковых цепей, в том
числе с е-аминогруппой Lys, имидазольным кольцом His и гидроксильной
группой Туг. Дансильные производные аминокислот образуются также в
результате взаимодействия пептидов или белков с дансилхлоридом и
последующего гидролиза полученного продукта соляной кислотой. В этом
случае дансильная метка вводится только по а-аминогруппе исходной N-
концевой аминокислоты (и некоторым реакционноспособным группам боковых
цепей), которую в дальнейшем можно идентифицировать методом ТСХ или ВЭЖХ.
Эта процедура широко используется в качестве непрямого метода
установления аминокислотной последовательности, получившего название
дансильного метода Эдмана, разработанного Греем и Хартли [19]. Следует
отметить, что при установлении аминокислотной последовательности
описанным способом некоторые аминокислоты модифицируются или разрушаются
в процессе кислотного гидролиза. Например, аспарагин и глутамин
дезаминируются, триптофан разрушается, а многочисленные модифицированные
аминокислоты теряются в процессе анализа. Тем не менее дансильные
производные аминокислот весьма удобны для аминокислотного анализа, так
как их мож-
186 Глава 4
Дансилхлорид
o=s=o
NH-CHR,-CO-NH-CHR2-CO-......
N
+ nh2-chh2-cooh +.....
o=s=o
NH-CHK!-C'OOH Дансильное производное аминокислоты
но обнаруживать на фемтомольном уровне, если пользоваться неводиыми
буферными растворами во избежание тушения флуоресценции.
