Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
41! 326 393
90, 91, 148
125, 281 247
303, 403 291, 317, 318
304, 339 ! 08
91, 106, 122
18, 91, 93, 94, 96, 148, !51, 152, 173, 190, 199, 205, 212, 356
91, 96, 148, 151
80, 229, 242, 243, 253, 305, 401
Аминокислоты, пептиды, белки 211
иыми остаточными силанольными группами. Для того чтобы исключить эти
нежелательные эффекты, следует, во-первых, подавить взаимодействие со
свободными силанольными группами и, во-вторых, подбирать условия
разделения таким образом, чтобы уменьшить полярность пептидных молекул.
Влияние свободных силанольных групп можно уменьшить путем добавления в
элюент солей или сильных кислот. Концентрация буферного раствора должна
быть порядка 0,1 М. Для уменьшения полярности пептидов
хроматографирование следует проводить при низких значениях pH (ниже 3,0),
так как при этом карбоксильные группы остатков аспарагиновой и
глутаминовой кислот, содержащиеся в их боковых цепях, практически не
диссоциируют. Однако при этих значениях pH боковые цепи остатков
аргинина, лизина и гистидина заряжены. Поэтому анион буфера следует
выбирать таким образом, чтобы он был способен образовывать ионную пару с
основными группами боковых цепей. Если следовать этим принципам, то ВЭЖХ
окажется необычайно гибким способом исследования благодаря высокой
селективности при выделении и очистке пептидов.
Для ряда условий разделения время удерживания пептидов, имеющих меньше
25 аминокислотных остатков, можно с определенной достоверностью
предсказать, исходя из их аминокислотного состава [90-94]. Удерживание
пептида можно рассматривать как сумму вкладов составляющих его аминокис-
лот. Аминокислоты с ароматической или большой алифатической боковой цепью
вносят основной положительный вклад в удерживание, аминокислоты с
кислотной боковой цепью--основной отрицательный вклад, а те из
аминокислот, которые имеют основную или маленькую нейтральную боковую
цепь, оказывают лишь малое отрицательное воздействие. Однако следует
помнить, что изомеры пептидов, время удерживания которых должно быть
предположительно одинаковым, в действительности элюируются раздельно. Для
пептидов, содержащих более 25 аминокислотных остатков, влияние
конформации делает предсказания еще менее достоверными.
Если ориентироваться на литературные данные, то за последние несколько
лет ряд определенных систем растворителей для обращенно-фазовой
хроматографии пептидов стал доминирующим. Если разделение проводят в
аналитических целях, т. е. если необходимы хроматограммы с хорошо
разрешенными острыми пиками, элюирование чаще всего проводят 0,1%-ной
фосфорной кислотой или фосфатными буферами, подкисленными до pH 2-3
фосфорной или хлорной кислотой [4, 70, 72-79, 95-108]. Протонированные
аминогруппы пептидов, вероятно, способны образовывать гидрофильные ионные
пары с остатками фосфорной кислоты, что приводит к снижению сродства
пептида к неподвижной фазе. Если элюирование ведется фос-
14*
212 Глава 4
Рис. 4.19. Разделение трипсинового гидролизата Са-связываю-щего белка
цыплят (30 мкг) методом обращенно-фазовой хроматографии [781. Неподвижная
фаза: (х-бондапак С"; элюент: 0,1%'Ная фосфорная кисло-та/ацетонитрнл,
градиентное элюирование: от 0 до 70% ацетонитрила за 1 ч; температура:
комнатная.
фатными буферами, можно применять неразрушающее обнаружение по поглощению
в УФ-области вблизи 200 нм, где любой пептид можно обнаружить даже в
очень малых концентрациях, поскольку пептидные связи поглощают в этой
области. Буферные растворы данного типа применяются в очень многих
областях, и время удерживания пептидов с известным аминокислотным
составом или последовательностью можно предсказать достаточно точно [90-
92]. Благодаря хорошему разрешению, достигаемому при элюировании
фосфатными буферами, эти системы очень удобны для идентификации пептидов,
контроля их чистоты и для создания пептидных карт (рис. 4.19). Недостаток
фосфатного буфера - его нелетучесть.
Триэтиламинофосфатные буферы, впервые предложенные Ривьером и др.
[109], находят все более широкое применение [80, 110-112]. У этих буферов
pH лежит в интервале от 2,2 до
6,5. При их использовании пики на хроматограмме имеют хорошую форму,
вероятно, вследствие эффекта маскирования остаточных доступных
силанольных групп неподвижной фазы и ион-парного взаимодействия с
пептидом. Обнаружение в этом случае можно проводить по поглощению в УФ-
области при 200-220 нм. Выход разделяемых пептидов достаточно высок, а их
биологическая активность, как правило, сохраняется.
Для препаративного разделения широко применяется предложенная Беннетом
и др. [117, 118] система растворителей на основе 0,1%-ной трифторуксусной
кислоты [71, 81, 82, 93, 94, 108, 119-126]. Пример использования такой
системы показан на рис. 4.20.
Разбавленный раствор трифторуксусной кислоты, входящий в состав
элюента, летуч и прозрачен в УФ-области до 205 нм. Его pH равен 2,2, а
концентрация 0,013 моль/л, т. е. она ниже,
