Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Аминокислоты, пептиды, белки 213
Рис. 4.20. Разделение трипсинового гидролизата амилоиодного компонента Р
плазмы методом обращенно-фазовой хроматографии [82].
Неподвижная фаза: ц-бондапак Си; элюент; 0,1%*ная трифторуксусиая
кислота/ацето** нитрил.
чем в фосфатной системе, однако последняя дает пики лучшей формы. В то же
время пептиды, особенно крупные, как правило, лучше растворяются в
трифторуксусной кислоте, что увеличивает их выход. Времена удерживания в
этой системе пептидов с известной аминокислотной последовательностью
также можно предсказывать [93, 94].
Другие перфторкарбоновые кислоты имеют те же преимущества, что и
трифторуксусиая кислота, но проявляют иную селективность вследствие
различия в размере и гидрофобности перфторалкильных групп. Это делает их
весьма удобными для проведения повторного хроматографирования. Однако
высшие перфторкарбоновые кислоты, как правило, трудно получать
необходимой степени чистоты П18].
Еще один полезный компонент буферных растворов для хроматографии
пептидов - ацетат аммония [83-86, 88, 89, 127- 130]. На рис. 4.21
приведен пример разделения с буфером этого типа. Ацетат аммония
достаточно летуч, и его можно использовать в такой же высокой
концентрации, как и фосфатные буферы. Его нормальный рабочий диапазон pH
от 4,0 до 6,0, т. е. это менее кислый буфер. Форма пиков, получаемых при
элюировании указанным буфером, не столь хороша, как при элюировании
фосфатным буфером. Из-за интенсивного поглощения ацетатом в УФ-области
при обнаружении при длинах волн меньше 210 нм могут возникать трудности.
Некоторые авторы пользуются буферной системой на основе разбавленной
соляной кислоты [131, 132]. Хотя этот буфер абсолютно прозрачен в УФ-
области и его успешно применяли
214 Глава 4
t.MMH
Рис. 4.21. Разделение трипсинового гидролизата белка Бенса Джойса методом
обращенно-фазовой хроматографии [128].
Неподвижная фаза: зорбакс Cs; элюент: А- 0,05 М ацетат аммония, pH 6,0, S
- 0,05 М ацетат аммония, pH 6,0/60%-иый ацетонитрил, градиентное
элюирование; температура;
60'С.
в ряде работ, его следует все же избегать, так как он корродирует даже
нержавеющую сталь.
Ацетат и формат пиридина - хорошие растворители для пептидов, что
давно известно из классической ионообменной хроматографии. Эти буферы
пригодны также для обращенно-фазовой ВЭЖХ. К сожалению, у них имеется
существенный недостаток: они сильно поглощают в УФ-области, что делает
невозможным обнаружение пептидов по поглощению в УФ-об-ласти. В этой
ситуации приходится пользоваться реакционными детекторами [87, 133-138].
Элюирование пептидов с обращенных фаз, как правило, проводится в
градиентном режиме с добавлением органического модификатора. Поскольку
удерживание пептидов в основном обеспечивается гидрофобным
взаимодействием, время удерживания должно уменьшаться с повышением
концентрации органического модификатора в элюенте. Это, однако,
справедливо только для концентраций органического модификатора, не
превышающих 40% [101, 102, 105]. При более высоких концентрациях
органического растворителя удерживание неподвижной
Аминокислоты, пептиды, белки 21S
Рис. 4.22. График зависимо*
сти log k от содержания ацетонитрила для ряда пептидных гормонов [101].
Неподвижная фаза: ц-бондапак Си; элюент: 0,015 М буферный раствор фосфата
триэтиламмо-Ния; гормоны: глюкагои, инсулин, В-цепь инсулина, ангнотен-
сии I, ангиотенсин II.
32 40 48
Ацетонитрил,%
фазой растет, как это показано на рис. 4.22. Возможно, что это происходит
из-за смены механизма разделения: обращенно-
¦фазовый механизм разделения сменяется полярно-фазовым, Считается, что
такое поведение является следствием возникновения различных конкурентных
сорбционных механизмов [101, 102, 105]. При низких концентрациях
органического растворителя преобладает адсорбция, обусловленная
гидрофобным взаимодействием, что и определяет порядок элюирования, обычно
наблюдаемый в обращенно-фазовой хроматографии. При более высоких
концентрациях органического модификатора остаточные свободные силанольные
группы, которые присутствуют вследствие неполной модификации поверхности
неподвижной фазы на основе силикагеля, повышают силанофильное ионное
взаимодействие между заряженными группами пептидов и поверхностью
неподвижной фазы.
Кривая, приведенная на рис. 4.22, предполагает динамическую
перестройку межповерхностного слоя между гидрофобной поверхностью
неподвижной фазы и подвижной фазой, что приводит к более сильному
взаимодействию пептида с полярными группами на поверхности неподвижной
фазы. Вид кривой, характеризующей зависимость времени удерживания от
содержания органического модификатора в подвижной фазе, индивидуален для
каждого пептида, и для более крупных пептидов и белков эта кривая более
крутая. Таким образом, для пептидов и белков оптимальное элюирование
может быть достигнуто только в сравнительно узком диапазоне концентраций
