Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 89

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 296 >> Следующая

чтобы растворять белки, и достаточно неполярной, чтобы их десорбировать.
Наибольшее распространение в качестве органических модификаторов для ВЭЖХ
белков получили ацетонитрил [242, 244, 246, 250, 255], 1-пропанол [247,
253, 254, 413, 416], 2-пропанол [245, 249, 257, 401, 413] и метанол [256,
258], а также их смеси [259, 263]. Авторы работы [242] описали
преимущества ацетонитрила и метанола над этанолом и пропанолами в
качестве органических модификаторов. Только при использовании первых двух
растворителей получаются острые хорошо разрешенные пики лизоцима
(относительная мол. масса 15 000), овальбумина и сывороточного альбумина
при разделении па 7-бондапаке Cis и фенильиых неподвижных фазах. При
элюировании пропанолом белки десорбируются при более низких концентрациях
органического модификатора, что может оказаться определяющим в ряде
случаев.
Некоторые белки неполностью выделяются из колонки при однократном
градиентном элюировании. Авторы работы [243] показали, что оставшиеся на
колонке белки можно удалить повторным градиентным элюированием (рис.
4.29). Более того, эти же авторы наблюдали частичную потерю на колонке
белков в результате их денатурирования под действием гидрохлорида
гуанидина. Авторы этой работы предположили, что белки в денатурированном
состоянии могут удерживаться на колонках вследствие прямого гидрофобного
взаимодействия или выпадения в осадок. Колонку можно очистить, а белок
вымыть из нее путем последовательного элюирования сначала 70%-ной
уксусной кислотой, насыщенной гидрохлоридом гуанидина, а затем
ацетонитрилом в обычном градиентном режиме. Белок выходит при градиентном
элюировании отдельным пиком при характерной для него концентрации
ацетонитрила. Этот результат был интерпретирован как обратное свертывание
белка из денатурированного состояния в конформацию, при которой его можно
элюировать.
Аналогичные наблюдения были сделаны Пирсоном и др. [245]. При
хроматографической очистке овальбумина на неподвижной фазе видак TP RP-8
в первом цикле элюируется только 60% нанесенного вещества, остальные 40%
постепенно десорбируются на протяжении последующих 11 циклов. Этот эффект
"памяти" обнаружен и для других белков, хотя степень его
Аминокислоты, пептиды, белки 22S
t.MHH
Рис. 4.29. "Эффект памяти" в обращеиио-фазовой хроматографии белков
[243]. я - разделение смеси белков (1 мг); б -холостое элюирование (белки
не наносили) сразу после разделения, показанного на рис. а.
Неподвижная фаза: ji-боидапак С"; элюеит: 0,05%-ная трифторуксусная
кисло-
та/0, ОЗД-иая трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиентное
элюирование.
проявления зависит от природы белка и условий хроматографического
разделения.
Для улучшения растворимости и повышения степени очистки ряда
мембранных белков с относительной молекулярной массой от 28 000 до 33 000
МакКин и Белл [264] добавляли 0,2% неионогенного детергента тритона X-100
в элюент состава триэтиламин/трифторуксусная кислота (pH
3,0)/ацетоиитрил. При замене анионогенного детергента додецилсульфата
иатрия на неионогенный при повторном градиентном элюировании нн один
белок из колонки не выделился. Явный недостаток тритона Х-100 - его
интенсивное поглощение в УФ-области, вынуждающее применять другие методы
обнаружения. Кроме того, перед последующими анализами или
хроматографическим разделением детергент приходится удалять.
Согласно опубликованным данным, в ряде случаев белки элюируются с
обращенных фаз с сохранением биологической активности. Трипсин и
химотрипсин (относительная мол. масса 25 000) были очищены
хроматографически на фазах Cis и CN с малым размером пор элюированием
смесью трифторуксусная кислота/ацетонитрил [250, 265]. Выделенные
активные ферменты были использованы для приготовления гидролизатов
белков. Авторы работы [255] разделили ряд кальцийсвязывающих белков,
например калмодулин, тропонин С, парвальбумии и др., на неподвижной фазе
ц-бондапак фенил при градиентном элюировании фосфатным буфером (pH
6,1)/ацетонитрилом.
230 Глава 4
Очищенные белки обладали биологической активностью. Эти авторы смогли
показать, что присутствие в элюате ионов кальция уменьшает время
удерживания некоторых белков, а это указывает на конформационные
изменения, вызываемые ионами кальция. Некоторые типы интерферона с
относительной молекулярной массой от 17 000 до 21000 были очищены методом
ВЭЖХ на обращенных фазах различных типов при нейтральных или кислых
значениях pH, причем очищенные белки сохраняли свою активность [251,
262].
Обращенно-фазовая хроматография была также использована для облегчения
связывания цис-комплекса платины с белками. Обнаружение осуществлялось по
поглощению в УФ-области и посредством атомно-абсорбционного анализа
[234].
4.3.3. Нормально-фазовая хроматография
В работах [139, 262, 397] описан особый случай распределительной
хроматографии. Применяя в качестве неподвижной фазы лихросорб диол, белки
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed