Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пептиды, образующиеся из аномального фибриногена под действием тромбина,
которые отличаются всего на один аминокислотный остаток [89].
По ряду причин ВЭЖХ оказалась особенно важной для работы с малыми
количествами пептидов. Так, для очистки требуется меньшее число стадий, и
потери соответственно уменьшаются. Кроме того, можно применять
неразрушающие методы обнаружения. Обычно используют высокочувствительное
обнаружение по поглощению в УФ-области при 200-220 нм.
t.MHM------*¦
Рис. 4.18. Разделение методом обращеино-фазовой хроматографии фибринопеп-
тидов нормального н аномального фибриногенов человека, образующихся под
действием тромбина [89].
а, в -аномальные фибриногены. Rouen (а) н Louisville (в); б -нормальный
фибриноген. Неподвижная фаза: лнхросорб RP-18; элюеит: 0.026 М ацетат
аммония (pH 6,0)/ацето-иитрил, градиентное элюирование от 6 до 17% ва 40
мии; температура: комнатная.
Аминокислоты, пептиды, белки 205
Тем не менее, если выбранная система растворителей делает обнаружение на
малых длинах волн невозможным, аналогичной чувствительности можно
добиться, прибегнув к послеколо-ночной модификации элюируемых соединений
нингидрином, флуорескамином или фталевым альдегидом, хотя при этом часть
образца пептида теряется в процессе анализа. Возможность сбора фракций,
содержащих образцы пептидов в малом объеме летучих растворителей, - еще
одно преимущество ВЭЖХ как метода изучения п анализа микроколичеств
пептидов.
Заслуживает внимания также следующее соображение: скорость разделения,
которая может быть достигнута при помощи ВЭЖХ, играет важную роль в том
случае, если существует опасность разрушения пептидов в процессе
хроматографирования. Компоненты растворителя, такие, как кислоты или
мочевина, могут в значительной степени модифицировать пептиды, что
приведет к потере биологической активности, увеличить гетерогенность
пептидной смеси, уменьшить выход целевого пептида и в итоге повлиять на
интерпретацию результатов.
Число публикаций, посвященных разделению пептидов и белков методом
ВЭЖХ, производит огромное впечатление, хотя эта методика появилась
сравнительно недавно. Ввиду огромного числа пептидов и белков,
неподвижных и подвижных фаз, методов обнаружения и других факторов,
учитываемых в процессе разделения и очистки, мы приведем таблицу, в
которой перечислим пептиды и белки, исследованные методом ВЭЖХ (табл.
4.3). Эта таблица поможет читателю получить представление о том, как
обстоят дела в этой области в настоящее время. Большое число примеров
использования различных принципов разделения и особенно полученных при
этом результатов будут приведены в последующей части раздела.
4.2.2. Немодифицированные пептиды
Большая часть методов разделения, описанных в литературе, относится к
разделению немодифицированных пептидов. В этих целях используются два
типа неподвижных фаз--ионообменные и обращенно-фазовые. Число публикаций,
описывающих разделение пептидов последним методом, значительно больше.
4.2.2.1. Обращенно-фазовая хроматография. Обращенно-фа-зовая ВЭЖХ -
предпочтительный метод разделения пептидных смесей. В принципе
немодифицированные пептиды вследствие их высокой полярности должны очень
плохо поддаваться разделению этим методом. Пептиды не способны в
достаточной степени связаться с гидрофобной поверхностью неподвижной
фазы, более того, они довольно прочно связываются со свобод-
Таблица 4.3. Пептиды и белки, разделявшиеся методом ВЭЖХ
Пептид/белок
Литература
N-Ацетилироваиные-перметилиро-ванные пептиды Ацетилхолияэстераза а-1-
Кислый гликопротеии Кислые белки яз минерализованных тканей
Родственные АКТГ пептиды
Актинпдин
Ацилпереносящий белок Белок, закодированный в аденовирусе
Аденилосукцинат-синтетаза
Альбумин
Алкогольдсгидрогеназа Альдегид-дегидрогеназа Альдолаза
Аллергены
Оксидаза D-аминокислот Аминопептидаза из Aeromonas pro-teolytica Амилаза
Амилоглюкозидаза Амилоидные белки Аигиотенснн
Антигены, связанные со стенкой клеток опухоли типа 1а Аполипоиротенн
Апротинин Арилсульфатаза Авидин
Бактериородопсин Белок Бенса Джонса Бомбезин БрадиКинин Белки мозга S 100
14-3-2 Церулеин Кальцииеврин Кальцитонин
Кальцийсвял.тающий белок
Калмодулин
167
390
280, 323
369
93, 94, 96, 97, 104, 106, 109, 111, 112, 114, 118, 120, 123,
148, 180,
183, 195, 199, 208, 234, 301, 371,
378, 399 72
72, 105 253
298
87, 143, 212, 234, 239, 242, 245,
247, 252, 257, 263, 270, 277, 278,
280, 283, 290, 293, 301, 306, 307,
309, 315, 317, 320, 321, 327, 329,
330, 332, 336, 341, 346-348, 351-
353 , 356-358 , 360 , 362-364 , 368,
370 , 389-391, 400 , 401, 403 , 404,
406, 416
143, 290, 364
305, 345, 364, 369
239, 301, 306, 313, 327, 351, 358,
362, 363, 370
308
337
137
277, 323, 394 358
82, 159
4, 70, 90, 91, 93, 96, 101, 103, 114, 129, 145, 148, 152, 180, 199, 301,
