Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пептидами, т. е. содержащими более 100 аминокислотных остатков, не
существует. Поэтому многие перечисленные выше факты, которые относились к
пептидам, можно с успехом отнести и к белкам, и мы их повторять не будем,
а обсудим некоторые специфические для ВЭЖХ белков аспекты. О
"хроматографических свойствах" белков в условиях ВЭЖХ известно
значительно меньше, чем о пептидах и аминокислотах. Вплоть до последнего
времени разделение белков редко проходило успешно: и разрешение, и выход
были гораздо хуже, чем при разделении пептидов, и обычно причиной этого
был неправильный выбор неподвижной фазы и элюента.
Большие трудности, с которыми приходится сталкиваться при разделении
белков методом ВЭЖХ по сравнению с разделением пептидов низкой
молекулярной массы, в значительной степени могут быть отнесены за счет
различия в параметрах растворимости и иной значимости конформационных
эффектов. Чем длиннее пептидная цепь, тем большее влияние оказывают
вторичная и третичная структуры на такие свойства, как растворимость и
поверхностная гидрофобность, что ведет к различиям в поведении по-разному
свернутых, а также нативных и денатурированых форм белков. Разделение
методом ВЭЖХ часто проводится в таких условиях, которые неблагоприятно
воздействуют на растворимость природных белков или влияют на их
конформацию. Так, экстремальные значения pH буфера и добавление к' нему
органических растворителей будут предположительно влиять и на
растворимость белка, и на его конформацию. Увеличение концентрации
органического модификатора и большая площадь контакта с поверхностью
неподвижной фазы могут вызывать денатурацию белка в процессе его
хроматографического разделения. Однако хорошо известно, что белки очень
сильно различаются по чувствительности к денатурирующему воздействию и
что некоторые из них способны восстанавливать исходную конформацию из
денатурированного-состояния. При проведении ВЭЖХ белков следует очень
четко представлять себе цель работы, т. е. твердо знать, что необхо-
224 Глава 4
димо экспериментатору - биологически активный образец или материал для
исследования химии белка. В первом случае следует подбирать такие
условия, при которых нативная структура сохраняется или
восстанавливается. Во втором случае можно выбирать из значительно
большего диапазона условий разделения. Очень часто приходится проводить
разделение белков в денатурированном состоянии, что иногда является также
существенным преимуществом.
Белки можно разделять на колонках с различными неподвижными фазами.
Разделение белков, как и пептидов, проводят на обращенных и ионообменных
фазах. Гель-проникающая хроматография используется в основном для
разделения белков. Разработан ВЭЖХ-вариант аффинной хроматографии белков.
Белки, разделяемые методом ВЭЖХ, перечислены совместно с пептидами в
табл. 4.3.
4.3.2. Обращенно-фазовая хроматография
Первые попытки разделения белков методом ВЭЖХ проводились на тех же типах
неподвижной фазы, которые применялись для разделения пептидов, т. е. на
неподвижных фазах с химически привитыми октадецнльными, цианопропильньши
или про-пилфенильными группами с размером пор 100 А и меньше. Авторы
одной из первых публикаций на эту тему, появившейся в 1976 г., описали
[239] успешное хроматографическое разделение высокомолекулярных белков, в
том числе овальбумина (45000),сывороточного альбумина (67 000) и каталазы
(58000), при градиентном элюировании системой фосфатный буфер (pH
2,0)/изопропаиол с добавкой метоксиэтанола (рис. 4.26).
Большинство исследований, в которых использовались неподвижные фазы с
размером пор 100 А, посвящены разделению белков малого и среднего
размера, таких, например, как рибо-иуклеаза (14 000) и цепи гемоглобина
(17 000) [139, 240-243]. Элюентом чаще всего служила система разбавленная
трифтор-уксусная кислота/ацетонитрил. Разделение в системе этого типа
представлено на рис. 4.27. Согласно данным работы [139], неподвижная
обращенная фаза RP-8 больше подходит для разделения белков, чем
обращенная фаза RP-18.
Основным достижением современной обращенной-фазовой ВЭЖХ как метода
разделения белков является разработка неподвижных фаз с большим размером
пор (больше 100 А). Эти фазы обладают большей селективностью и
обеспечивают больший выход продукта. Отличные хроматограммы получены
рядом авторов [244-247] на неподвижной фазе видак ТР на основе силикагеля
с порами размером 330 А. На этих колонках были разделены такие
высокомолекулярные белки, как колла-
Рис. 4.26. Разделение белков методом обращенно-фазовой хроматографии
[239].
Неподвижная фаза: нуклеосил ODS; элюент: градиент от 10 до 50% Б в А, А
- 0,005 М двуэамещенный фосфат калия/2-метоксиэтанол (pH 2,0),
установлено фосфорной кислотой, Б - изопропанол/2-метоксиэтанол (pH 2,0),
установлено фосфорной кислотой; температура: 47 °С.
Номер фракции
Рис. 4.27. Разделение цепей глобина (330 мкг) из крови (меченные [3Н]-
лейцином) методом обращенно-фазовой хроматографии [240].
