Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 90

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 296 >> Следующая

плазмы крови и интерферон можно разделить в градиенте снижающейся
концентрации "-пропанола, например от 80 до 50% органического
модификатора. Поскольку все белковые компоненты сыворотки крови
элюируются из колонки с фронтом растворителя, если она предварительно
уравновешена 50%-ным н-пропанолом, этот вариант хроматографического
разделения был интерпретирован как нормальнофазовая хроматография [139].
Этот вариант разделения пригоден только для гидрофобных белков, способных
растворяться при высоких концентрациях органического растворителя. При
разделении этим способом противовирусная активность интерферона не
теряется [262, 397].
4.3.4. Ионообменная хроматография
ВЭЖХ-вариант ионообменной хроматографии белков очень похож на ее
классический вариант в том отношении, что функциональные группы
неподвижной фазы и системы растворителей, применяемые и в том, и в другом
случае, аналогичны. Однако традиционные материалы для набивки колонок на
основе целлюлозы, сшитого декстрана и аналогичных соединений недостаточно
механически прочны для работы в условиях высоких объемных скоростей и
больших давлений, в связи с чем возникла необходимость в материалах
нового типа. На материалах нового типа разделение протекает значительно
быстрее и с лучшим разрешением. Последнее обусловлено тем, что частицы
новых неподвижных фаз имеют сферическую форму, малые размеры, однородны
по размерам, отличаются высокой
Аминокислоты, пептиды, белки 231
пористостью, высокой ионообменной скоростью и поверхностной
гидрофильностью.
Для получения подходящего материала для ионообменных ВЭЖХ-колонок было
использовано много различных подходов (см. обзоры [266-268]). В
частности, предпринимались попытки разработать неподвижные фазы па основе
как органических, так и неорганических материалов. Первые успехи в этом
направлении были достигнуты Микешом и др. [269], использовавшими
производные метакрилатного геля, Чангом и др. [270. 271] и Кудиркой и др.
[272], работавшими со стеклом с контролируемой пористостью.
Первые ионообменные фазы на основе неорганических материалов с
модифицированной поверхностью были получены путем присоединения
диэтиламиноэтильных (ДЭАЭ), метил-диэтиламиноэтильных (четвертичный АЭ),
карбоксиметильны.х (КМ) или сульфопропильных (СП) функциональных групп к
модифицированному глицерилпропилсилилом носителю (гликофаза), который
представляет собой стеклянные частицы с контролируемой пористостью [270,
271]. Как показывает
табл. 4.5, на носителях такого типа был разделен ряд белков. Следует,
однако, отметить, что этот тип носителя в продажу не поступает.
Позднее были разработаны анионообменники на основе микропористых
сферических частиц силикагеля, покрытых тонким (пленочным) слоем
полиэтиленимина. Эти неподвижные фазы поступают в продажу под названием
синхропак АХ-300. Диаметр пор этого материала равен 300 А. Это слабый
анионо-обменник, по своим ионообменным характеристикам близкий к ДЭАЭ-
целлюлозе. Однако, поскольку в основу его положен силикагель, рабочие
значения pH соответствуют диапазону от 2 до 8. На синхропаке АХ-300
проведено разделение нескольких различных белков (табл. 4.5), в том числе
ряда изоферментов [273, 274, 298] и гемоглобинов различных типов [275,
276]. Достигнутое разрешение близко к наблюдаемому при гель-электрофорезе
[277]. На рис. 4.30 показана хроматограмма, полученная при разделении
изоферментов лактат-дегидрогеназы.
Авторы работы [278] показали, что хотя у коротких колонок (размером
50X4 мм) емкость по белку в 5-10 раз меньше по сравнению с длинными
(размером 250X4 мм), первые сохраняют приблизительно 75% разрешающей
способности [278]. На колонках размером 250X4 мм можно разделять до 10 мг
таких белков, как сывороточный альбумин, овальбумин или аполи-попротеин
[278, 279]. Выход белков с колонок, в том числе и по ферментативной
активности, составляет около 85% [266]. Однако при очистке малых
количеств фермента их, как выяснилось, следует разбавлять раствором
альбумина для получения воспроизводимых результатов [268]. На колонках
можно прово-
Таблица 4.5. Применение ионообменной хроматографии для разделения белков
Неподвижная фаза Характеристика неподвиж Функциональная группа
Соединение Литера
ной фазы
тура
ДЭАЭ-гликофаза Слабый анионообменник Диэтиламиноэтил- Щелочная
фосфатаза, арилсульфатаза, бел 270---273,
иа основе стекла ки
плазмы крови, целлюлаза, креатин- 278---292
киназа,
гемоглобин, лактатдегидрогеназа,

гомогеиат печени, альбумин, трипсин
Синхропак АХ-300 Слабый анионообменник а-1-
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed