Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Неподвижная фаза: (t-бонда пак Си; элюент: 0,3%-ная трифторуксусиая
кислота/ацето-нитрнл, градиентное элюирование.
15-1489
226 Глава 4
Рис. 4.28. Разделение S-карбоксиметилированного фибриногена (а), S-
карбок-симетилированиого фибрина (б) и меркаптилированных цепей фибрина
(е) методом обращенно-фазовой хроматографии [246].
Неподвижная фаза: видак TP RP-10; элюент: 0,1%-ная трнфторуксусная
кислота/ацето-
нитрил, градиентное элюирование.
ген, фрагменты коллагена, сывороточный альбумин, овальбумин, цепи
фибриногена; молекулярная масса большинства соединений составляла от 40
000 до 300 ООО. Работа [246] может служить примером такого разделения
(рис. 4.28). Выход белкового материала достигал 85% [246, 247).
Большой размер пор неподвижной фазы не всегда, однако, может
гарантировать хорошие результаты хроматографического разделения, так как
тип силикагелевой матрицы также оказывает существенное влияние на
селективность. Сравнение ряда неподвижных фаз с большим диаметром пор
показало [245], что неподвижная фаза видак ТР с размером пор 330 А
наиболее предпочтительна для разделения белков, несмотря на то что
лихросфер Si 1000 с размером пор 1000 А и имеет ряд преимуществ при
разделении особенно крупных белков [248]. В работе [416] опубликованы
результаты прямого сравнения модифицированных октилом неподвижных фаз
типа фаз Бейкербонда с размерами пор 100 и 330 А, а также еще несколькими
модифицированными неподвижными фазами.
Пирсон и др. [245] и Махони [413] исследовали влияние размеров
колонки на разделение белков и обнаружили, что они слабо влияют на
разрешение, но оказывают решающее воздействие на емкость. Неподвижная
фаза видак TP RP-8 способна связывать около 20 мг смеси сывороточный
альбумин/овальбу-
Аминокислоты, пептиды, белки 227
мин при использовании колонки размером 250X4 мм. Избыточный белок
элюируется в виде пика пробоя колонки вследствие недоступности центров
связывания. Как выяснилось, количество белка, который можно нанести на
колонку, приблизительно пропорционально ее размерам. Поскольку короткие
колонки разделяют белки приблизительно с такой же эффективностью, что и
длинные, было высказано предположение, что белки взаимодействуют с
носителем по механизму многоточечного связывания [413] и разделение
происходит по механизму адсорбция-десорбция на поверхности неподвижной
фазы [249], а не в результате распределения между неподвижной и подвижной
фазами. Эта интерпретация результатов объясняет, в частности, почему
градиентное элюирование при ВЭЖХ белков значительно более эффективно, чем
изократическое.
Следует отметить, что порядок элюирования компонентов белковой смеси
зависит не от их молекулярных размеров, а от ряда других свойств белка,
таких, как гидрофобность, заряд поверхности молекулы и конформация
основной и боковой цепей. Эффективную поверхностную гидрофобность и заряд
таких больших молекул невозможно рассчитать, исходя из их общего
аминокислотного состава [312], и поэтому предсказывать время удерживания
белков значительно труднее, чем время удерживания пептидов [93].
В обращенно-фазовой ВЭЖХ белков чаще всего используются летучие
органические кислоты или летучие буферные растворы. В многочисленных
публикациях описывается применение разбавленной трифторуксусной кислоты
[241, 242, 245, 246, 250, 413], реже - разбавленной пентафторпропионовой
или гептафтормасляной кислоты [244, 413]. Длинные углеродные цепи
последних двух кислот увеличивают гидрофобность молекул белка в
результате ион-парного взаимодействия и тем самым увеличивают время
удерживания либо, наоборот, повышают гидрофобность подвижной фазы и тем
самым уменьшают время удерживания. Элюирование муравьиной кислотой
высокой концентрации обеспечивает хорошее разделение и высокие выходы для
многих нативных и модифицированных белков [401]. Во многих случаях для
разделения были выбраны такие буферные системы, как пиридин/муравьиная
кислота, pH около 4,0 [139, 247, 251-253, 416], и пиридин/уксусная
кислота, pH около 5,0 [247, 252, 254]. Однако ввиду сильного поглощения в
УФ-области при малых длинах волн муравьиной и уксусной кислот, а также
пиридина обнаружение белков можно осуществлять только по поглощению при
280 нм, применяя послеколо-ночную обработку элюата флуорескамином или
другим реагентом, либо измерять радиоактивность меченых соединений или их
биологическую активность (см. также раздел "Пептиды"), Во многих
публикациях описывается применение для приготов-
15*
22i Глава 4
ления элюемта нелетучих солей, в основном фосфатов [255- 259J, при pH 6,0
или 2,0, иногда в сочетании с перхлоратами [260, 261]. Из числа других
нелетучих солей следует отметить трис-ацетат [260] и ацетат натрия [262]
при pH 7,5.
В качестве органических модификаторов в ВЭЖХ белков используются в
принципе те же соединения, что и для разделения пептидов. Однако следует
подчеркнуть трудность выбора системы растворителя достаточно полярной,
