Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
отрицательно заряженные силанольные группы отрицательно влияют на процесс
разделения. Удовлетворительные материалы были получены путем модификации
поверхностных силанольных групп силикагеля и стекла глицерилпропил-
силильными группами; эти материалы получили название гликофазы и диолфазы
[271]. Авторы работы [301] проводили химическое присоединение N-
ацетиламинопропильных групп; полученные таким способом материалы были
названы амино-фазы.
В настоящее время в продажу поступает большое число неподвижных фаз,
предназначенных для водной гель-проникаю-щей ВЭЖХ. Получившие наибольшее
распространение материалы для этого типа белковой ВЭЖХ и их пределы
эксклюзии приведены в табл. 4.6. Свойства ряда колонок, выпускаемых
промышленным способом, рассмотрены в работе [404].
Во многих статьях описаны свойства и области применения материалов,
выпускаемых фирмой Toyo Soda Corporation, которые называются TSK-гели. В
продажу поступает три различных типа материалов (табл. 4.6): SW, PW и HW.
TSK-гель типа SW разработан на основе силикагеля, и диапазон рабочих
значений pH соответственно лежит в пределах от 2 до 8. Этот
240 Глава 4
материал имеет весьма гидрофильную поверхность с большим числом
гидроксильных групп. Начиная с 1978 г. он широко используется для очистки
белков и определения их характеристик [302-311]. В литературе сообщается
о хороших выходах белков и сохранении ими биологической активности при
хроматографировании на материалах этого типа.
Гель SW может иметь поры различных размеров. Соответствующие им
диапазоны разделения были тщательно изучены, и колонки, заполненные этим
гелем, были использованы для определения размеров белковых молекул. Как
выяснилось, градуировочные кривые зависимости объема элюирования от
молекулярной массы, полученные при элюировании обычными буферами [302,
303, 306, 307, 313-320], отличаются от полученных при работе с буферами,
содержащими такие денатурирующие агенты, как 6 М. гидрохлорид гуанина
[321-324], 0,1 %-ный додецилсульфат натрия [327-332] или 1 %-ный
додецилсуль-фат натрия/20%-ный метилцеллозольв [335]. Соответствующие
приблизительные диапазоны разделения указаны в табл. 4.6. Некоторые
градуировочные кривые, опубликованные в работах [314, 322, 328],
представлены на рис. 4.34.
На принципиальную важность правильного подбора концентраций
додецилсульфата натрия и солей буфера для успешного элюирования указывают
авторы работ [327, 328, 332]. Этот факт можно проиллюстрировать следующим
наблюдением, При использовании 8 мМ раствора детергента в воде без солей
такие белки, как сывороточный альбумин, овальбумин и |3-лакгоглобулин,
элюируются в свободном объеме колонки. При использовании 0,74 мМ раствора
детергента в 0,1 М фосфатном буфере все они разделяются. В 0,46 мМ
растворе детергента в 0,2 М фосфатном буфере они вновь элюируются
одновременно, но время удерживания значительно возрастает [322].
Оптимальная концентрация буфера при использовании 0,1%-ного
додецилсульфата составляет 0,05-0,2 М [328].
Белки, которые разделяли в присутствии 6 М гидрохлорида гуанидина или
0,1%-ного додецилсульфата натрия, предварительно меркаптолизировали и S-
алкилировали [321, 322, 328] или только меркаптолизировали [327, 329].
Как метод определения молекулярной массы гель-проникаю-щую ВЭЖХ можно
сравнить с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия. Электрофоретический метод отличается более
высоким разрешением и допускает параллельный анализ нескольких образцов.
Однако хроматографический метод превосходит его по чувствительности,
возможности количественной обработки результатов анализа и простоте
выделения разделенных компонентов, Время, затрачиваемое на проведение
одного хроматографического цикла, меньше необходимого для проведения
одного электро-
Рис. 4.34. Градуировочные кривые, полученные для белков методом гель-про-
никающей хроматографии на TSKSW в различных условиях [314, 322, 328].
Неподвижные фазы: TSK SW, указаны на рисунках; элюент: а - 0,1 М фосфат
натрия, (pH 7,0), 0,3 М хлорид натрия; 6-0.1 М фосфат натрия (pH 6,0), 6
М гуаиидиигидро* хлорид, в - 0,1 М фосфат иатрия (pH 7,0), 0,1%
додецнлсульфат натрия.
16 -Н8Э
242 Глава 4
форетического цикла, в основном благодаря отсутствию стадии окрашивание -
обесцвечивание. Количества пробы примерно одинаковы для обоих методов.
Соответствующий диапазон разделения при использовании хроматографического
метода может быть выбран, из размера пор, что аналогично выбору состава
геля в электрофоретическом методе. Поведение полипептидов с высоким
содержанием углеводов в структуре было специально исследовано
применительно к этому типу хроматографии [323].
Авторы работы [336] разработали "двумерную" систему для разделения
белков сыворотки крови: сначала разделение осуществляется методом
изоэлектрической фокусировки, а затем в другом направлении - методом
гель-проникающей ВЭЖХ на колонке с TSK 3000 SW. Таким способом можно
