Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
органического модификатора. Этим объясняется тот факт, что при
216 Глава 4
разделении пептидов и белков градиентное элюирование, как. правило, дает
лучшие результаты, чем изократическое, и что пептиды элюируются узкими
пиками. Однако в связи с вышеизложенным следует отметить, что
концентрация органического растворителя влияет на растворимость и
конформацию пептидов, а изменение конформации может повлиять на
взаимодействие пептид - неподвижная фаза. Очевидно, что неверный выбор
условий градиентного элюирования может привести к потерям или плохому
разделению пептидных компонентов. На практике рекомендуется использовать
очень пологие линейные градиенты (изменение концентрации органического
растворителя не больше 1% в минуту) и избегать высоких концентраций
органического модификатора. Следует обратить особое-внимание на то, чтобы
при выбранной концентрации органический модификатор не вызывал выпадения
в осадок солей, буфера.
Наиболее распространенный органический модификатор - ацетонитрил. Он
прозрачен в УФ-области до 200 нм и характеризуется хорошей
селективностью. Это лучший органический модификатор при разделении
пептидов, но при разделении гидрофобных белков, которые элюируются только
при высокой концентрации ацетонитрила, следует помнить, что белки могут
выпасть в осадок и, следовательно, быть потеряны.
В ряде случаев в качестве органического модификатора используют
изопропанол и н-пропанол, которые отличаются большей элюирующей
способностью по сравнению с ацетонитрилом [139, 140]. Хотя форма пиков и
разрешение в этом случае хуже, элюирование достигается при более низких
концентрациях органического модификатора, чем при введении в элюент
ацетонитрила или метанола. Поскольку пропанол интенсивно поглощает при
длинах волн меньше 230 нм, обнаружение пептидов следует проводить на 280
нм (при этой длине волны поглощают пептиды, содержащие тирозин и
триптофан) или использовать для обнаружения химическую реакцию.
Путем соответствующего выбора неподвижной фазы также можно менять
селективность и разрешение при разделении. На гидрофобность поверхности
неподвижной фазы влияют: тип силикагеля, размер пор, размер частиц,
содержание углерода, тип введенного заместителя и степень замещения.
Наибольшее распространение получили обращенные фазы с углеродными
цепями Cis и Cs. В общем случае с увеличением гидрофобности неподвижной
фазы эффективность разделения возрастает, но при этом существует
опасность потери части пептидов. Цианопропильные неподвижные фазы более
полярны, чем фазы Cie или Се, и поэтому более пригодны для разделения
очень гидрофобных пептидов. Некоторые широко используемые неподвижные
фазы и их свойства приведены в обзоре [141].
Аминокислоты, пептиды, белки 217
Для крупных пептидов (мол. масса свыше 4000) разделение на обращенных
фазах с большим размером пор (300 А) дает лучшие результаты, чем
разделение на обычных обращенных •фазах с размером пор от 60 до 100 А
[142, 143].
Помимо неподвижной фазы и элюента на разделение пептидов влияет еще
ряд параметров.
Оптимальная объемная скорость должна составлять от 1 до 2 мл/мин.
Влияние температуры подробно не исследовано, но складывается
впечатление, что повышение температуры не дает ощутимых преимуществ.
Зависимость времени удерживания от температуры минимальна.
Очень важно начинать работы по разделению методом ВЭЖХ с проведения
холостого опыта, т. е. градиентного элюирования без ввода пробы. Как
правило, на колонке содержится большое количество соединений, поглощающих
в УФ-области, которые могут элюироваться даже спустя несколько часов
после окончания предыдущего разделения. Более того, часто на
хроматограммах появляются ложные пики - это элюируются загрязнения,
содержащиеся в воде или органическом модификаторе.
Количество пептидов, которое можно наносить на обычную аналитическую
колонку (250X4,6 мм), может достигать нескольких миллиграмм. Для
разделения очень больших проб следует выбирать колонку с радиальным
сжатием [144-146].
Объем растворителя, в котором растворяют пробу, должен быть
минимальным. Можно наносить и большие объемы, но форма и разрешение пиков
(особенно тех соединений, которые элюируются первыми) будут при этом
ухудшаться.
Выход пептидов при обращенно-фазовой хроматографии, как правило,
очень высокий и составляет 80-100% даже при разделении микрограммовых
проб. Однако он зависит от природы каждого конкретного пептида. Трудно
связать размер получаемого пика с количеством пептида, если он
неизвестен, так как и пептидные связи, и аминокислотные остатки,
присутствующие в пептиде, вносят свой вклад в суммарное поглощение в УФ-
области. УФ-спектры индивидуальных аминокислот приведены на рис. 4.23.
4.2.2.2. Ионообменная хроматография. ВЭЖХ-вариант ионообменной
хроматографии как метод очистки пептидов в настоящее время находит весьма
ограниченное применение. Вероятно, это связано с большей гибкостью
