Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Байер и сотр. [20] первыми опубликовали сообщение о разделении
дансильных производных аминокислот методом ВЭЖХ на двухколоночной системе
с лихросорбом Si60 (5 мкм) за 30 мин [20]. Разделение проводилось при
температуре 65 °С при градиентном элюировании смесями
бензол/пиридин/уксусная кислота/пиридин/уксусная кислота. При
использовании флуоресцентного детектора (длина волны возбуждающего
излучения 340 нм, испускаемого 510 нм) предел обнаружения составляет
порядка нескольких фемтомолей. В этой же работе описана обращенно-фазовая
система, при помощи которой можно разделить большинство дансильных
производных стандартных аминокислот.
В литературе было описано несколько удобных способов разделения всех
аминокислот, образующихся при кислотном или ферментативном гидролизе
белков [21-24, 405]. Примером может служить хроматограмма, показанная на
рис. 4.9
Аминокислоты, пептиды, белки 187
t,MHH
Рис. 4.9, Разделение дансильных производных аминокислот методом обрахцен-
но-фазовой хроматографии [24].
Неподвижная фаза: сфернсорб гексил, 5 мкм; элюент: фосфат, pH
6,0/ацстоннтрнл; элюирование в градиентном режиме; температура: 34 СС.
/ -цистопи; 2 - Asp; 3 - Glu; 4 - дансилсульфокнслота; 5 - Ser; 6 - Thr;
7 - Gly; 5 - Ala; 9 - Met (O); /0 - Abu; //" Arg; /2 -Pro; 13 - Val; /4 -
Met; /5-lie; /5 -Leu;
/7 -Phe; 18 - данснлхлорнд; /Р - цнстнн; 20 -• дансиламнд; 21 - Lys; 22 -
His; 23 - Туг,
[24]. Методика воспроизводимого модифицирования аминокислот с высоким
выходом приведена в работе [25].
Предел обнаружения дансильных производных аминокислот можно
улучшить, если для возбуждения флуоресценции вместо УФ-излучения
использовать химическую реакцию [26]. Хемилюминесценция дансильных
производных аминокислот может быть вызвана в результате взаимодействия с
бис-
о о о о
II н н п
Аг-С-С-Аг + Н202 -> С-С + 2 АгОН
Эфир щавелевой 0-0
кислоты
1,2- Диоксэтаи - 1,2 - Дион
0 О
II II
с-с *
1 I + флуорофор--------" флуорофор щ + 2 СОг
0-0 (возбужденное
состояние)
Флуорофор*--"¦ Свет + флуорофор
188 Глава 4
(2,4,6-трихлорфенил)оксалатом и пероксидом водорода. Предполагаемый
механизм этой реакции показан выше на схеме. В этом случае предел
обнаружения может быть даже менее одного фемтомоля.
4.1.3.3. Диметиламиноазобензолсульфониламинокислоты (ДАБС-
аминокислоты). Авторы работы [27] описали систему, предназначенную для
анализа аминокислот с пределом обнаружения на уровне нескольких пикомолей
и использованием предколоночной модификации свободных аминокислот ДАБС-
хлоридом - еще одним из реагентов типа реагента Сэнгера [27].
>^O-n=n^O-s0iCi •+ nh2-c-cooh
Н3С V-/ i
ДАБС-С1
Н3О н
/NH0^N=N-<0)_so2_NH-(r_cooH Н3с
R
ДАБС-производное аминокислоты
При тщательно подобранных условиях эта реакция воспроизводима. ДАБС-
производные аминокислот разделяются методом обращенно-фазовой
хроматографии при градиентном элюировании с использованием двух различных
систем. Поскольку эти производные имеют интенсивную окраску, обнаружение
проводится по поглощению в видимой области (при 436 нм), достигаемый
предел обнаружения составляет 3-5 пмоль каждой аминокислоты. Все
стандартные аминокислоты, присутствующие в белковом гидролизате, за
исключением Asp и Ser, разделяются при градиентном элюировании смесью 50
мМ ацетат натрия, pH 4,13/ацетонитрил. Неразрешающиеся аминокислоты можно
разделить, проводя элюирование второй системой 28 мМ фосфатный буфер, pH
7,2/ацетонитрил, однако все остальные ДАБС-производные аминокислот
разделяются в этом случае значительно хуже, чем в первой системе.
4.1.3.4. Нитробензоксадиазолпроизводные (НБД-производ-ные). Авторы
работы [28] использовали НБД-фторид в качестве реагента для
предколоночного введения флуоресцентной метки и разделили полученные
производные, в том числе Pro и Нур, методом ВЭЖХ [28]. Пробу обрабатывали
НБД-фтори-дом при pH 8,0 и 60 °С в течение минуты. Производные 18
аминокислот были разделены на обращенной фазе, причем их
Аминокислоты, пептиды, белки 189
NBO-OH
j~JU
м
У
Рис. 4.10. Разделение НБД-производных аминокислот (10 пмоль) методом
обращенно-фазо-вой хроматографии [28].
Неподвижная фаза: ц-боида-пак Ci8, Ю мкм; элюент: 0,1 М фосфат (pH
6,0)/мета-
нол/тетрагидрофуран.
20
40
бо
предел обнаружения может составлять 10 фмоль, если длина возбуждающего
излучения составляет 470 нм, а испускаемого-530 нм (рис. 4.10).
о
7 - Фтор -4 - нитробензо-
