Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Cys(CH2COOMe), Суз(пиридилэтил),
Суз(сульфопропил), ацетил-Lys, сук-
цинил-Ьуз(ОМе), NIe,
(r)Tr-Gly(OMe), ФТГ-Рго(ОМе),
PTU, DPTU
(His/Ala) 55
хорошо разделяющиеся соединения.
при высокой чувствительности. Кроме того, возможность использования
более простой установки ВЭЖХ.
Как следует из табл. 4.2, выбор условий, при которых можно
разделить все стандартные аминокислоты и многие их производные,
достаточно велик. Проблемы возникают только при разделении групп Ser/Gln,
Met/Val/Pro и Phe/Ile/Lys/Leu. Особенно тщательно следует подбирать
температуру, pH, форму градиента или состав растворителя, так как все эти
параметры играют важную роль в процессе разделения. Установлено, что
время удерживания Arg и His меняется в зависимости
196 Глава 4
t.MKH
Рис. 4.14. Разделение ФТГ-производных аминокислот методом обращенно-фа*
зовой хроматографии [531 -
Неподвижная фаза: лихросорб RP-18 (5 мкм); элюент: 68,5% ацетат натрня
(pH 5,2)/31,5% ацетонитрил/0,5% дихлорэтан, нзократическое элюирование;
температура: 62
от времени жизни колонки, но эти сдвиги можно полностью откорректировать,
меняя концентрацию буфера [53].
4.1.3.7. Диметиламиноазобензолтиогидантоиновые производные (ДАБТГ-
производные). В анализе аминокислотной последовательности пептидов
классический реагент фенилизотио-
цианат можно заменять на диаминобензолизотиоциаиат (ДАБИТЦ), который дает
окрашенные ДАБТГ-производные аминокислот. Их можно регистрировать в
видимой области при 436 нм с пределом обнаружения от 1 до 5 пмоль. В
работе [56] описано разделение ДАБТГ-производных аминокислот методом
обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 4.15) [56].
Одна пара ДАБТГ-производных аминокислот, а именно Leu/Ile не
разделяется. Следует отметить, что все ДАБТГ-производные стандартных
аминокислот можно разделить методом ТСХ с приблизительно таким же
пределом обнаружения. Кроме того, ТСХ позволяет различать ДАБТГ- и ДАБТК-
произ-водные (диметиламиноазобензолтиокарбамил), т. е. различные
Аминокислоты, пептиды, белки 197
t, мин
Рис. 4.15. Разделение ДАБТГ-производных аминокислот методом обращенно-
фазовой хроматографии [56].
Неподвижная фаза: зорбакс ODS; элюент: 0,035 М ацетат (pH
5,0)/ацетоинтрил, гради-ентное элюирование; температура: 22 °С.
продукты, образующиеся в процессе последовательного расщепления пептидов,
так как эти производные окрашены по-разному. Главное преимущество ВЭЖХ-
анализа ДАБТГ-производных аминокислот - возможность количественной
обработки результатов. Следует, однако, помнить, что реакция сочетания
ДАБИТЦ с пептидными аминогруппами не дает количественного выхода.
Н3С
н,с
ДАБИТЦ
н
N = t:=s + -NH-X
II
О
Пептид
pH 8-10
^N-^~^-N=N-/~y-NH-C-NH-CH-C-NH-X Нз1- S О
Н.С
ДАБТК - пептид н*
у-N=N-^/-Y--------' >U
HaC" _
н к
ДАБТГ~производное аминокислоты
%
198 Глава 4
4.1.3.8. Метилтиогидантоиновые производные (МТГ-произ-
водные). Последовательное расщепление пептидов и белков может быть
выполнено с использованием метилизотиоцианата (реагента типа реагента
Эдмана).
? ?
CH3-N = C=S + NH2-СН-С-NH-X -> CH3-NH-C'-NН-СН-С-NНХ О
SO
Метил изотиоцианат Пептид МТК-пептид
R
CHo-NH-С-NH-CH-С-NHX CH3-NH-C=NH + NH3X
S О S^CHR
А
€Ho-NH-C=NH J I I
S^CHR
Конечные продукты, т. e. МТГ-производные аминокислот, анализируют обычно
методами ТСХ, ГХ и масс-спектрометрии. В работе [57] описан анализ МТГ-
производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием
градиентного элюирования. Этим методом было разделено большинство из 20
наиболее распространенных аминокислот.
4.1.3.9. Дифенилинденонилтиогидантоиновые производные (ИТГ-
производные). К числу реагентов, предназначенных для анализа
аминокислотной последовательности пептидов, дающих окрашенные
производные, относится также дифенилинде-нонилизотиоцианат (см. схему на
стр. 199).
Окрашенные ИТГ-производные аминокислот до последнего времени
идентифицировали только методом ТСХ. Однако автор работы [58]
опубликовала сообщение о разделении этих производных методом ВЭЖХ.
Проводя элюирование тремя различными системами растворителей, можно
разделить почти все ИТГ-производные аминокислот.
4.1.4. Энантиомерные аминокислоты
Методы разделения пар энантиомеров аминокислот, т. е. их L- и d -форм,
приобретают все большее значение. При проведении биохимических
