Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
2 -окса-1,3- диазол
Н
+ NH2-C-COOH R
Н
o2n-/ V nh-(|;-cooh
N N
'о
НБД-
производное аминокислоты
4.1.З.5. Фталевого альдегида производные (ФА-производ-ные).
Предколоночная модификация фталевым альдегидом очень часто используется
для определения аминокислот в биологических жидкостях и белковых
гидролизатах. Нефлуоресцирующий реагент взаимодействует в присутствии
восстановителя, например меркаптоэтанола, с первичными аминогруппами, и
образует флуоресцирующие производные. Этим методом не-
С НО
С НО
+ HS-CH2-CH2-OH + H,N-R
&
N-R
190 Глава 4
Рис. 4.11. Разделение производных аминокислот н фталевого альдегида
методом обращенно-фазовой хроматографии [30].
Неподвижная фаза: ультрасфер ODS, 5 мкм; элюент: ТГФ/0,05 М ацетат натрня
(pH 6,6)/метанол, лннейно-ступенчатое градиентное элюирование.
возможно определять пролин, а цистеин дает очень слабый сигнал.
Предварительная обработка пробы иодуксусной кислотой приводит к
образованию производных цистеина, обладающих интенсивной флуоресценцией
[29]. Разделение ФА-производ-аых аминокислот обычно выполняют на
обращенных фазах за 30-50 мин, используя многоступенчатое градиентное
элюирование и флуоресцентный детектор (длина волны возбуждающего
излучения около 330 нм, испускаемого 460 нм). Как показали авторы работы
[30], предел обнаружения может достигать нескольких пикомолей (рис. 4.11)
[30]. В работах
[31, 32] описаны другие хорошие системы для разделения ФА-производных
аминокислот. Авторы работы [33] обрабатывали аминокислоты смесью фталевый
альдегид/этандиол, получаемые при этом производные отличаются более
интенсивной флуоресценцией [33].
4.1.3.6. Фенилтиогидантоинпроизводные (ФТГ-производные).
Оригинальным реагентом, используемым для непосредственного анализа
аминокислотных последовательностей, является фенилизотиоцианат (ФИТЦ) или
реагент Эдмана, впервые описанный более 30 лет назад [34]. С его помощью
выполнена большая часть работ по установлению первичной
Аминокислоты, пептиды, белки 191-
структуры белков. При последовательном разложении пептидов протекает
такая серия реакций [35]:
н R
т <Q)-N=C=S + Niy-CH-C-NHX ----------" <^)-NH-C-NH-rH-C-NHX
Фенил- Пептид ФТК-пептид
изотиоцианат
к
/P^S-NH-C-NH-CH-C-NHX {f^)-NH-C=NH + NH3X
s о s4"chr
II
о
АТЗ-производное
аминокислоты
•ш /f^\_NH-C=NH + Н20 -* <f^>-NH-C-NH-CHR-COOH + Н4
Svc.CHR
и
О
NH-C-NH-CHR-COOH -5-"-
S
s н R
ФТГ-производное
аминокислоты
Реакции I, II, III называются реакциями сочетания, расщепления и
конверсии соответственно. Продукты этих реакций -
фенилтиокарбамилпроизводные (ФТК-производные) пептидов или аминокислот,
анилинотиазолинонпроизводные (АТЗ-производные) и фенилтиогидантоиновые
производные (ФТГ-производные) аминокислот соответственно. Эти реакции
очень часто выполняются автоматически в белково-пептидном секвенаторе.
Конечные продукты реакции, ФТГ-производные аминокислот, можно
идентифицировать при помощи бумажной, тонкослойной или газовой
хроматографии [35], методом аминокислотного анализа после проведения
гидролиза, масс-спект-рометрии или разработанной позднее ВЭЖХ. Внедрение
ВЭЖХ [37] коренным образом изменило процедуру установления
последовательности благодаря значительному снижению количества материала,
необходимого для проведения анализа, так как метод ВЭЖХ на три порядка
чувствительнее, чем, например, тонкослойная хроматография, и допускает
количественную обработку результатов. Во многих лабораториях достигнут
предел обнаружения около 5 пмоль, обнаружение осуществляет по поглощению
в УФ-области при 254-269 нм.
•92 Глава 4
t.MHH
Рис. 4.12. Разделение ФТГ-производных аминокислот методом обращенно-фа-
зовой хроматографии [37].
Неподвижная фаза: зорбакс ODS; элюент: 0,01 М ацетат натрия/ацетонитрнл,
градиент-ное элюирование, температура: 62 °С.
Задача разделения ФТГ-производных стандартных амиио--кислот весьма
сложна из-за больших различий их полярности. Авторы одной из первых
работ, проводимых в рассматриваемом направлении, [38] решили эту проблему
следующим •образом: гидрофобные и гидрофильные производные аминокислот
разделяются на различных колонках путем изокра-тического элюирования. Эта
