Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
- это алифатические соединения, к которым УФ-детекторы не чувствительны.
12.2.1. Витамин B'i (тиамин)
Тиамин (рис. 12.9) служит кофактором ферментов промежуточного углеводного
обмена, а также играет важную роль в механизме нервного возбуждения [81-
83]. Классический химический метод анализа витамина Bi-тиохромная
реакция, в результате которой в щелочной среде образуется флуоресцентный
тиохром.
Cl-
Рис. 12.9. Структура тиамина.
Определение тиамина может быть осуществлено при помощи различных
методик ВЭЖХ: ион-парной, катионо- и аиионо-обменной хроматографии,
хроматографии на аминофазе и обращенных фазах (С-2, С-8, С-18). Тиамин
определяют как таковой, используя для его обнаружения УФ-детектор, или же
переводят в тиохром до или после хроматографического разделения.
Витамины 597
Каждый из этих методов имеет свои преимущества, и выбор зависит от
конкретной задачи, стоящей перед исследователем. Поскольку при кислых или
нейтральных значениях pH тиамин- это четвертичный амин, его
хроматографическое поведение в значительной степени зависит от pH и
ионной силы элюента. Это, в частности, показали авторы работы [84],
которым удалось элюировать тиамин с катионообменной колонки, заполненной
катионообменником зипакс SCX только при щелочных pH элюента (0,05 М
ЫаНгРС^ при pH 9 и 0,8 М NaC104). Авторы работы [85] провели
систематическое изучение удерживания водорастворимых витаминов, включая
тиамин, при использовании различных методов ВЭЖХ: обращенно-фазовой (С-
18), ион-парной (С-18) и ВЭЖХ на аминофазе. Во всех этих случаях время
удерживания в значительной степени зависело от pH элюента.
Водорастворимые витамины сильно различаются по полярности, поэтому во
многих случаях их разделению способствует градиентное элюирование, как
это показывают результаты работы [86].
В табл. 12.9 приведен исчерпывающий обзор работ, в которых
рассматривается анализ тиамина при помощи ВЭЖХ с применением различных
неподвижных фаз.
12.2.2. Витамин В2 (рибофлавин)
Рибофлавин (рис. 12.10) обычно определяют флуоресцентными методами,
сравнивая спектры флуоресценции исследуемой пробы в окисленном
(флуоресцирующая форма) и восстановленном (лейкоформа) состояниях, чтобы
определить содержание рибофлавина в пробе [94, 95]. Для определения
рибофлавина в биологических жидкостях используется и ряд других методов:
ТСХ [96], микробиологический [97] и протозоологический [98]. Для
идентификации и определения содержания рибофлавина, как и других
водорастворимых витаминов, пригодны различные методы ВЭЖХ. Вследствие
возрастания потребности в определении общего содержания водорастворимых
витаминов в фармацевтических препаратах широкое распространение получили
методы группового отделения этих соединений (некоторые из них указаны в
табл. 12.9). Авторы работы [99] описали проведенное Юрандом [100]
разделение на колонке с силакагелем с привитыми короткоцепочечными
алкильными группами смеси, состоящей из кофеина и витаминов В2, В3 и В6,
при элюировании смесью метанол/вода/аммиак (85:15:25), содержащей 0,1%
лаурилсульфата натрия. Длительность разделения составляет менее 10 мин,
пики всех соединений достигают нулевой линии.
Рибофлавин, аминокислоты, витамины В6, С и ниацинамид были разделены
на аминофазе [101]. Эту смесь можно разде-
Таблица 12.9. Методы разделения соединений группы витамина В при помощи
ВЭЖХ
Исследуемые соединения Неподивжная фаза Элюеиг
Применение Лите-
ратура
Ниацин, витамины В2 и В6, фолие ---NH2" 1 мМ
№Н2Р04/ацетонитрил Фармацевтические пре- 86
вая кислота, витамин В! (80 : 20)
параты
Витамин С, фолиевая кислота, вита С-8(r) А: 1% (NH4)2C03,
Б: ме- Фармацевтические пре- 86
мин Вв, ниацин, витамин Bi, В2 таиол; градиент
от А до параты
Б, 4%/мин
Ниацин, витамины Be, Вь В2, С, фо С-2(r) А: 0,5%
гексадецилтриме- Фармацевтические пре- 86
лиевая кислота
тиламмонийбромида, параты
Б: метаиол;
градиент от
5 до 60% Б,
3%/мин
Ниации, ннацинамид, пиридоксин, С-18е 5 мМ
гексамультавитамин- Поливитаминные препа- 87
тнамин, рибофлавин ный сульфонат
натрия в раты
смеси 1%-иая
