Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
разделение. Очистка цис-транс-нзомеров при помощи ТСХ и ЖХ приводит к
неоднозначным результатам (относительно их биологической активности),
что, по-видимому, объясняется степенью чистоты получаемых фракций.
Авторы работы [71] установили, что в процессе метаболизма происходит
взаимное превращение филлохинона и 2,3-эпок-сифиллохинона, и подобрали
несколько водных обращенно-фазовых систем ВЭЖХ для разделения этих
соединений [72-74]. Неводные обращенно-фазовые системы ВЭЖХ [75]
отличаются высокой эффективностью разделения, позволяют повысить
растворимость образцов, понизить рабочее давление и удлинить время жизни
колонки, как это показали авторы работы [76] на примере разделения
витамина Ki и его эпокси- и хлорпроиз-водных, проведенного на зорбаксе
ODS при элюировании 30%-ным раствором дихлорметана в ацетонитриле.
Эти же авторы осуществили разделение на нормальной фазе в системе ВЭЖК
2/,3/-^нс-хлорпроизводного витамина Кь его гранс-хлорпроизводного, 2',3'-
цис-К.1, 2',3/-чис-Кгэпоксида, гранс-Кл-эпоксида и транс-Ki на
сферисорбе-5 при элюировании 25%-ным раствором сухого дихлорметана в
гексане [76].
Ранее предложенные методики разделения на обращенных фазах [77--79]
позволяют отделить бактериальные менахиноны от филлохинонов,
продуцируемых растениями. Менадион, мена-хинон-3, 2,3-эпоксименахинон-
4,2-деметилменахинон-4 и менахи-нон-4 (указаны в порядке их элюирования)
разделены на колонке с партисилом ODS при элюировании смесью
ацетонитрил/вода (66:33) [74], однако для разделения филлохинонови их
эпоксипроизводных, с одной стороны, и МК-4, МК-3 и их эпок-
О
СН3
CH2-CH=(j:--СН2-СН2-СН2-СНДСН
СН31_ CH3J3
Филлохинон (витамин КО
О
О
Менахинон-п (витамин К2)
Рис. 12.7. Структура соединении группы витамин:! К.
Витамины 595
сипроизводных - с другой, необходимо несколько элюентов. Те же авторы
установили, что ТСХ можно с успехом использовать для предварительной
обработки пробы с целью удаления мешающих соединений из исходных липидных
фракций [74]. Авторы работы [80] объединили адсорбционную и обращенно-фа-
зовую ВЭЖХ с тем, чтобы исключить стадию предварительной очистки и
сохранить уровень витамина Ki в сыворотке крови. После удаления белков
сыворотку экстрагируют н-гексаном, экстракт упаривают досуха, остаток
растворяют в элюенте для ВЭЖХ и разделяют на силикагеле, элюируя 0,2%-ным
ацето-нитрилом в н-гексане. В результате такого предварительного
фракционирования получают три фракции, одну из которых, содержащую
витамин Кл, собирают, упаривают, растворяют далее в элюенте для
последующего разделения на обращенной фазе (неподвижная фаза ODS, элюент
- 8%-ный раствор ди-хлорметана в ацетонитриле). Выход после экстракции
превышает 90%, общий выход 60-89% при использовании витамина транс-3H-Ki
в качестве внутреннего стандарта. На неподвижной фазе с привитыми CN-
группами наблюдают следующий порядок элюирования: витамин Кь эпокси-Ki,
МК-4 и МК-9 (неподвижная фаза - RSilCN, элюент - 0,05%-ный раствор
ацетонитрила в н-гексане). Ацетонитрил предпочтительнее дихлорметана,
поскольку увеличивает селективность разделения. Физиологический уровень
витамина Кл в сыворотке крови, как известно, составляет 5-30 нг/мл, а
предел обнаружения метода равен 500 пг/мл, следовательно, ВЭЖХ вполне
пригодна для определения витамина К в биологических жидкостях.
12.2. Водорастворимые витамины
Для разделения и количественного определения водорастворимых витаминов
можно применять самые различные хроматографические методики, поскольку
молекулы этих соединений содержат ионогенные группы. Однако исследования
водорастворимых витаминов с привлечением адсорбционной ВЭЖХ проводятся
довольно редко, в то время как для работ, посвященных изучению
жирорастворимых витаминов, характерно обратное. Изучение витаминов первой
группы осуществляется методами обращенно-фазовой, ионообменной и ион-
парной хроматографии. На рис. 12.8 показана хроматограмма, полученная при
разделении ряда водорастворимых витаминов при помощи обращенно-фазовой
ВЭЖХ. Возможности обнаружения витаминов этой группы также значительно
шире, поскольку можно прибегать к методам, основанным на наличии у
соединений ионогенных групп. Так, в настоящее время в этих целях с
успехом применяются электрохимические методы.
38*
596
Глава 12
i ё
^ У
¦ Рис. 12.8. Разделение водо-
i растворимых витаминов на
I обращенной фазе при высо-
\ кой концентрации солей в
\ элюенте [88].
\ Колонка: 300X4,2 мм; неподвиж-
\ ная фаза: С)8 (10 мкм), элюент:
\ 0,5 М раствор сульфата лития в
\ смеси метанол/вода (5:95);
V объемная скорость: 1,5 мл/мин;
обнаружение: УФ-детектор,
______254 им.
t, МИН
Следует отметить, что в литературе отсутствуют какие-либо данные о
разделении биотина, пантотеновой кислоты и витамина В12, поэтому мы
исключили их из обсуждения. Дело в том, что пантотеновая кислота и биотин
